Métabolomique et modèles de reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome
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1. Introduction

2. Exemples de données et d'outils nécessaires à l'élaboration de modèles de reconstruction métabolique

3. Description de la reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome

a. La démarche

b. Amélioration d'un modèle de reconstruction métabolique

c. Illustration de l'amélioration d'un modèle de reconstruction

4. Formalisme décrivant les vitesses des réactions d'un sytème

5. La matrice de stoechiomètrie S

 

6. Les modèles de reconstruction métabolique sous contraintes

a. Introduction

b. L'état stationnaire

c. L'analyse de la balance des flux dans les grandes voies métaboliques

d. Exemples de fonctions objectif pour les modèles sous contraintes

e. La biomasse - la croissance - GAM et NGAM

f. Exemples de méthodes d'analyse des modèles de reconstruction métabolique sous contraintes

7. Etude du contrôle du métabolisme glucidique lié au diabète de type 2

8. La base de données de modèles : "Biomodels" - EBI

9. Liens Internet et références bibliographiques

 

1. Introduction

a. Le métabolome et la métabolomique

Sensu stricto, la métabolomique est l'analyse (identification, quantification, classification, découverte, ...) des molécules impliquées dans le métabolisme d'un organisme.

Ces molécules sont appelées métabolites :

  • ils appartiennent à toutes les familles de macromolécules biologiques : acides aminés, oses, lipides, acides nucléiques, protéines, vitamines, hormones, composés du métabolisme secondaire (antibiotiques, pigments, polyphénols, alcaloïdes, flavonoïdes, ...).
  • ils sont très nombreux : estimation entre 5 104 et 2 105 métabolites dans le règne végétal (métabolisme secondaire important).
  • ils sont de nature physico-chimique, de masse molaire et de concentration très diverses.

L'ensemble des métabolites constitue le métabolome :

  • C'est un ensemble très dynamique puisqu'il résulte des modifications du métabolisme en réponse aux variations de conditions de vie d'un organisme.
  • Le métabolome résulte du métabolisme : l'analyse métabolomique permet d'étudier l'adaptation du métabolisme aux modifications d'environnement ou de comparer les métabolismes de différents organismes.
  • Cette approche met en évidence des réactions biochimiques non encore identifiées et, par voie de conséquence, les enzymes (qui catalysent ces réactions) jusqu'à lors inconnues.

Techniques d'analyse du métabolome :

  • Les techniques les mieux adaptées à l'analyse du métabolome sont la spectromètrie de masse et la résonance magnétique nucléaire (RMN). Les techniques actuelles ne permettent d'analyser que des métabolites de masse molaire limitée (quelques kDa).
  • La micro-spectroscopie Raman, la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, les méthodologies dérivées du FRET ("Fluorescence / Förster resonance energy transfer", en particulier BRET - "Bioluminescence initiated RET") sont des techniques capables de détecter des métabolites à l'échelle de cellules individuelles ("single-cell biology").
  • Les molécules BODIPY (bore dipyrométhene) constituent un groupe de colorants dont certaines études ont indiqué une limite de détection de 1 zmole (= 10-21 mole).

Le NIH ("National Institutes of Health") a annoncé un investissement de 14,3 millions de dollars en 2012 (et probablement 51,4 millions de dollars sur 5 ans) pour le développement de la métabolomique.

Selon certains analystes, la demande mondiale en métabolomique a été évaluée à plus de 675 millions de dollars en 2015 et devrait dépasser 2,5 milliards de dollars en 2021 (croissance supérieure à 25% entre 2016 et 2021).

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b. Modèles de reconstruction du métabolisme à l'échelle d'un génome

De plus en plus de génomes sont séquencés ou en cours de séquençage. Voir les bases de données suivantes :

Les modèles du métabolisme à l'échelle d'un génome établissent le lien entre les informations issues du séquençage de ce génome (et les informations issues des analyses subséquentes de ce génome), les données biochimiques et métaboliques et les phénotypes liés à ce métabolisme.

Cette démarche est récente car elle est la conséquence logique de tous les domaines antérieurs en "omique".

domaine omique metabolomics genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE stoichiometric matrix matrice stoechiometrie reaction rate flux balance biochimej

Quelques terminologies anglo-saxonnes :

  • "Genome-scale metabolic reconstruction", "Metabolic network reconstruction", "Genome-scale measurement, modelling and predicting of dynamic metabolic networks",
  • acronyme GENRE = "GEnome-scale Network REconstruction"
  • acronyme GEM = "Genome-scale metabolic model"
  • ...

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c. Accroissement du nombre de modèles de reconstruction du métabolisme à l'échelle d'un génome

Le premier modèle de reconstruction du métabolisme à l'échelle d'un génome a été publié en 1999 pour Haemophilus influenzae (Edwards & Palsson, 1999).

Pour l'homme :

  • AGORA : les modèles de reconstruction du métabolisme à l'échelle d'un génome dérivés des données de métagénomique de l'intestin humain (AGORA - « human gut metagenomic ») contribuent à expliquer comment les communautés microbiennes modulent le métabolisme et la santé de l'homme (Magnusdottir et al., 2017)
  • Virtual Metabolic Human Database

La figure ci-dessous montre le nombre croissant de modèles de reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome.

modele reconstruction echelle genome genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE biochimej

Source : Kim et al. (2012) - orange : eukaryotes / bleu : prokaryotes / vert : archaea

Le nombre de modèles croit exponentiellement : 30% des modèles ont été construits depuis 2010.

Un nombre croissant de modèles d'Eucaryotes (beaucoup plus complexes) sont construits. Parmi eux, on note 3 plantes :

La figure ci-dessous montre le nombre cumulé de modèles du métabolisme à l'échelle d'un génome ("GEnome-scale Network REconstruction" - GENRE). La figure b indique le nombre d'enzymes annotées selon leur numéro EC ("Enzyme commission") intégrées dans les modèles.

modele reconstruction echelle genome genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE biochimej

Source : Monk et al. (2014)

Voir : "Whole genome metabolism models available" - BioModels Database - EBI

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d. Les difficultés pour modéliser pleinement le métabolisme (liste non-exhaustive)

  1. le nombre colossal de réactions biochimiques, donc de métabolites etd'enzymes
  2. l'existence de famille multigénique codant une même enzyme
  3. les modifications post transcriptionnelles : les différents transcrits issus d'un même gène :
  4. les modifications post-traductionnelles : l'existence de plusieurs isoformes d'une même enzyme
  5. la compartimentation cellulaire qui peut séparer un substrat de l'enzyme qui l'utilise : nécessité d'un transporteur sans lequel la réction ne peut avoir lieu
  6. l'adressage (peptides signaux) des protéines à des compartimentaux distincts
  7. les réactions réversibles (au voisinage de l'équilibre) et les réactions irréversibles (ΔG' << 0)
  8. les paramètres physico-chimiques : température, pH, force ionique, co-facteurs ...
  9. la modulation de la concentration des enzymes (voire de leurs inhibiteurs protéiques) : interférence ARN)
  10. la structure IV d'une enzyme (cas de plusieurs sous-unités différentes)
  11. les complexes multienzymatiques
  12. les enzymes qui agissent sur différents substrats avec des KM trés différents
  13. la modulation de l'activité enzymatique : fixation coopérative, régulation allostérique - fixation d'effecteurs (inhibiteurs ou activateurs - effets homotropes ou hétérotropes)
  14. la spécificité large de classes de substrats pour certaines enzymes (exemple : les alcool déshydrogénases - EC 1.1.1.1) ou les enzymes qui agissent sur des acides gras de longueur ou de degré de saturation variables
  15. les concentrations réelles d'enzymes et/ou de métabolites (Bennett et al., 2009) : trés large gamme des concentrations intracellulaires qui s'échelonnent du pM au mM
  16. les concentrations limitantes d'enzymes et/ou de métabolites
  17. la connectivité des métabolites qui reflète leur fréquence d'utilisation dans diverses réactions (et donc leur interaction avec d'autres métabolites)
  18. métabolites et / ou enzymes non encore connus : exemple de la découverte tardive du fructose 2,6-bisphosphate, modulateur clé de la régulation de la glycolyse et de la néoglucogénèse
  19. les "entrées - sorties" : les nutriments et les déchets (notion de biomasse)
  20. ...

Figure ci-dessous : un exemple très simple en regard de la réalité biologique pour illustrer la complexité des phénomènes cellulaires

Systeme cellulaire complexe genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE biochimej

  • le gène 1 code pour une enzyme E1 qui transforme le métabolite M1 en M2 avec hydrolyse de l'ATP
  • E2 et E4 sont 2 isoformes codées par 2 gènes distincts (famille multigènique)
  • le gène 3 code pour 2 ARN messagers (épissage alternatif) donc 2 enzymes
  • E3 est modifiée post-traductionnellement
  • M4 rétro-inhibe E4
  • M4 et M5 (métabolite d'une autre voie) sont substrats de E5, issue d'un épissage alternatif du gène 3
  • ...

Cas des réactions et des enzymes manquantes (connues et/ou non connues)

  • L'équilibre des masses peut être vérifié sur la base des compositions chimiques des métabolites (base de données spécifiques telle que Pubchem).
  • Il ne peut y avoir de métabolites associé à un coefficient stoechiomètrique nul ou négatif. L'exemple ci-dessous est incohérent ("inconsistent") puisque le coefficient associé à C doit être nul.
     k1 
 A -----> B
     k2 
 A -----> B + C      
  • Les modèles peuvent être irréalistes sur le plan thermodynamique. Il faut alors "rendre réversible" une réaction qui est irréversible. Cette correction est complexe car il faut compulser des données qui n'existent pas forcément (voire calculer des valeurs de ΔG') et la vérification est trés coûteuse en temps de calcul.
  • Les métabolites jamais consommés ou produits ("dead-ends metabolites") sont des révélateurs trés utiles pour mettre en évidence des réactions (métabolites et/ou enzymes) qui manquent : une réaction qui manquerait dans une voie linéaire annulerait le flux. Or, pour que le modèle soit fonctionnel, il ne doit pas y avoir de flux non-nul prédit.

Gevorgyan et al. (2008) "Detection of stoichiometric inconsistencies in biomolecular models" Bioinformatics 24, 2245 - 2251

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2. Exemples de données et d'outils nécessaires à l'élaboration de modèles de reconstruction métabolique

a. Les données

La reconstruction du métabolisme à l'échelle d'un génome intègre l'ensemble des données issues (liste non exhaustive) :

  • du séquençage des génomes et détermination de leur structure (génomique structurale)
  • de l'expression spatio-temporelle des gènes (génomique fonctionnelle)
  • du taux spatio-temporel réel des ARN messagers (transcriptomique)
  • du taux spatio-temporel réel de protéines (protéomique)
  • des bases de données de voies métaboliques : KEGG pathways, KEGG genes & proteins, BioCyc (EcoCyc, MetaCyc, AraCyc, YeastCyc, ...)
  • des bases de données généralistes (recueil d'informations) sur les gènes, les ARN messagers, les protéines, les métabolites et autres (NCBI, EBI, Uniprot, TransportDB , ...)
  • des bases de données sur les enzymes : réactions catalysées, paramètres cinétiques, substrats, produits, co-facteurs, effecteurs et autres (Brenda, Enzyme , ...)
  • des bases de données d'annotation des gènes et des protéines : Gene Ontology, KAAS (KEGG Automatic Annotation Server), DAVID , ...
  • des bases de données de la littérature scientifique :NCBI PubMed, ...
  • des données biochimiques accumulées depuis des décennies : décryptage des voies métaboliques, données thermodynamiques (en particulier ΔG' des réactions), concentration des métabolites, vitesse des réactions enzymatiques, paramètres cinétiques des enzymes ...

Metabolomique metabolomics genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE biochimej

La métabolomique et les modèles de reconstruction du métabolisme à l'échelle d'un génome nécessitent donc de fouiller ("data mining") une quantité colossale de données et, bien souvent, de les nettoyer (les "curer" - curators).

Ce travail méticuleux, extrêmement gourmand en temps est laborieux et systématique.

Les nouvelles données, déduites de l'analyse de l'ensemble de ces informations de base, constituent donc une sorte de "sur-information".

  • données concernant les possibilités métaboliques d'une cellule (ou d'un organisme) à s'adapter / évoluer dans tel environnement : un lien est alors établi entre le génome, le métabolisme et le phénotype.
  • précision concernant l'histoire évolutive d'une cellule (ou d'un organisme).
  • confirmation ou infirmation du rôle majeur de telle réaction enzymatique dans la régulation du flux de telle voie métabolique.
  • confirmation ou infirmation des corrélations établies entre gènes, enzymes et réactions catalysées.
  • mise en évidence de maillons métaboliques manquants : enzymes ou métabolites qui n'auraient pas été identifiés mais dont l'existence s'impose sur la base du bon fonctionnement des modèles.
  • comparaison de métabolisme intra- et inter-espèces : cette partie est la plus difficile car il faut avoir des modèles reconstruits pour les espèces comparées et ces modèles doivent être construits avec les mêmes nomenclatures, formalismes et structures de fichiers.
  • enfin et non des moindres : modification et améliorations d'espèces par ingénièrie ("knockout", accroissement de la transcription de gènes par "familles de facteur de transcription", ingénièrie des protéines, insertion de synthèse dans une voie métabolique, modifications de flux métabolique, ...). Par exemple, en mutant la séquence d'un promoteur constitutif, Alper et al. (2005) ont construit une banque de promoteur de différentes forces permettant de moduler la vitesse de transcription d'un même gène au niveau désiré selon le promoteur inséré en amont. Cela permet de contrôler la vitesse de transcription de toutes les enzymes d'une voie métabolique afin d'en optimiser le flux.
  • Voir Durot et al. (2009)

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b. Les outils

Le premier pas est d'identifier l'ensemble des réactions, les métabolites impliqués et leur stoechiomètrie et les enzymes qui catalysent ces réactions.

Les techniques de mesures quantitatives les plus utilisées sont :

Les annotations fonctionnelles disséminées dans les bases de données doivent donc être compulsées, triées et les plus complètes possibles afin d'être traduites en un ensemble de réactions détaillées.

La classification EC ("Enzyme Commission") de "Enzyme" fournit un système non ambigu d'association entre enzymes et réactions catalysées.

Figure ci-dessous, exemples d'outils logiciels pour la reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome. Les outils évoluent très rapidement et de nouveaux outils de plus en plus performants sont régulièrement développés.

methode method genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE biochimej

Source : Pitkänen et al. (2010)


Exemples d'algorithmes / programmes pour la reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome
RFBA : "Regulatory Flux Balance Analysis" EBA : "Energy balance analysis with Flux Balance Analysis"
SR-FBA : "Steady-state Regulatory Flux Balance Analysis" TMFA : "Thermodynamics-based Metabolic Flux Analysis"
GapFind/GapFill GrowMatch : "An Automated Method for Reconciling In Silico/In Vivo Growth Predictions"
GeneForce : "An Automated Phenotype-Driven Approach (GeneForce) for Refining Metabolic and Regulatory Models" SMILEY algorithm
TIGER : "Toolbox for integrating genome-scale metabolic models, expression data, and transcriptional regulatory networks"  

Exemples de bases de données pour la reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome
GOLD ("Genomes OnLine Database") : base de données de tous les génomes séquencés ou en cours de séquençage CMR ("Comprehensive Microbial Resource") : ensemble d'informations et de programme pour l'analyse des génomes de procaryotes
GeneCards : base de données de gènes de l'homme YMDB : "The Yeast Metabolome Database"
Enzyme : base de données de nomenclature des enzymes avec les N° EC associés Brenda : base de données d'enzymes
TCDB ("Transporter Classification Database") : protéines de transport membranaires BioCyc (contient les sous-bases de données EcoCyc (Escherichia coli K-12), AraCyc (Arabidopsis thaliana) , ...) : voies métaboliques et programmes pour les analyser
Pubchem : base de données de métabolites metaTIGER : base de données de voies métaboliques et d'informations phylogénomiques pour un trés grand nombre d'eucaryotes
IntAct : base de données d'interactions entre protéines STRING : "Known and Predicted Protein-Protein Interactions"
The Model SEED : "A resource for the generation, optimization, curation, and analysis of genome-scale metabolic models" MetaRoute : "web interface for interactive navigation through genome-scale networks and local network visualization"
ERGO : "Comparative analysis of genomes and generation of sophisticated metabolic and cellular reconstructions" KEGG ("Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes") : base de données pour l'étude des systèmes biologiques
Gene Ontology, DAVID , ... : annotation

KAAS (KEGG Automatic Annotation Server) : annotation

Les grandes bases de données généralistes : NCBI, EBI, Uniprot, PFAM, PDB, ...

Voir la traduction en langage SBML d'un modèle de reconstruction pour le maïs (C4GEM).

SBML : "Systems Biology Markup Language"

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3. Description de la reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome

a. La démarche

C'est une démarche itérative : la comparaison avec la réalité biologique permet d'ajuster le modèle puis de le confronter de nouveau aux données réelles et ainsi de suite, afin d'améliorer ce modèle (voir la figure 1 de Balagurunathan et al., 2012).

  • Recensement du maximum d'informations de tous types pour élaborer un modèle de base à affiner.
  • Création d'un premier modèle de reconstruction métabolique à l'échelle du génome de l'organisme étudié.
  • De manière conjointe :
    1. analyse bioinformatique du modèle de reconstruction
    2. mesures des paramètres biochimiques et physiologiques réels qui rendent compte d'une croissance optimale de l'organisme

modele reconstruction metabolique echelle genome biochimejmodele reconstruction metabolique echelle genome genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE biochimejmodele reconstruction metabolique echelle genome biochimej

Source : Lewis et al. (2012)

  • Comparaison des résultats prédits par le modèle avec les mesures réelles (ci-dessous).
  • Le modèle est affiné : intégration ou élimination (sophistication) de données.
  • Le processus de reconstruction recommence.

modele reconstruction metabolique echelle genome genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE biochimej

Source : Lewis et al. (2012)

La reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome s'appuyant massivement sur des méthodes bioinformatiques, elle est trés largement prédictive. Mais elle permet d'orienter de futures expériences dans des voies prometteuses et épargne un temps précieux de recherche au hasard.

Bien évidemment, il existe une étape clé: la confrontation de ces modèles avec la réalité biologique. Cette étape est d'autant plus importante que les modèles peuvent être modifiés, améliorés comme tout système d'apprentissage.

Remarques :

  • beaucoup de termes anglo-saxon n'ont pas une traduction "évidente" et claire
  • il y a un emploi important d'acronymes en métabolomique
  • de nouveaux mots en "omique" font leur apparition, sans qu'ils aient un sens réel tant que les domaines afférant n'ont pas été pleinement développés ("fluxomique" - étude de l'ensemble des flux métaboliques, "réactomique" et pourquoi pas ... "cellulomique").
  • voir un cours sur les domaines en "omique".

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b. Amélioration d'un modèle de reconstruction métabolique

Figure A (ci-dessous) : le 1er modèle dit "à plat"

  • Les métabolites (cercles vert et noirs), les réactions enzymatiques (Ex) et les transporteurs (Tx) sont extraits de l'annotation du génome et de différentes bases de données.
  • Le cercle vert S (en haut à gauche) représente l'entrée d'un substrat initial dans la voie métabolique et les cercles bleus représentent les produits (P1 à P5) en dehors (à priori) de cette voie métabolique.
  • Les couleurs (noire et verte) des réactions enzymatiques indiquent que plusieurs gènes codent la même enzyme (exemple : E10 et E37).
  • Les points d'interrogation sont des exemples de lacunes ("gap") qui imposent une amélioration de ce 1er modèle afin de combler ces lacunes ("gap filling") et déboucher sur une analyse in silico réaliste et efficace, c'est-à-dire dont on peut tirer des informations.

Metabolomique metabolomics modele reconstruction metabolique echelle genome genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE iterative procedure biochimej

Source : Gomes de Oliveira Dal'Molin & Nielsen (2013)

Figure B : amélioration du 1er modèle

  • La recherche ou l'obtention (expérimentale) de nouvelles informations permet d'introduire la compartimentation qui sépare la glycolyse cytosolique et la glycolyse plastidique du cycle de Krebs dans les mitochondries.
  • La compartimentation permet aussi d'allouer les enzymes aux différents organites.
  • iI en découle la nécessité de transporteurs (T1 à T5, jusqu'à lors non mis en évidence) pour permettre le transport de métabolites entre organites.
  • De nouvelles réactions enzymatiques (jusqu'à lors non mises en évidence) peuvent être également proposées (E13 et E16).

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c. Illustration de l'amélioration d'un modèle de reconstruction

Les méthodes traditionnelles pour les études protéomiques d'organites se traduisent souvent par une spécificité limitée des protéines étudiées, la perte de matériel biologique et d'éventuelles contaminations du fait des étapes d'isolement des organites et de purification de leur contenu en protéines.

Une méthode récente permet de minimiser ces inconvénients : elle utilise un marquage spécifique des protéines de la matrice de la mitochondrie par la biotine, tandis que la cellule est vivante, avec toutes ses membranes et ses complexes protéiques intacts et que les relations spatiales entre les protéines sont préservées.

La méthode utilise une enzyme, l'ascorbate peroxidase (APEX), modifiée par ingénierie. L'APEX est spécifiquement adressée à la matrice mitochondriale par fusion à un peptide d'adressage de 24 acides aminés. Une fois dans la matrice mitochondriale, l'APEX marque par biotinylation (liaison covalente) les protéines voisines (mais pas les protéines lointaines) dans les cellules vivantes.

L'APEX est active dans tous les compartiments cellulaires et elle oxyde de nombreux dérivés du phénol en radicaux phénoxyl.

Ces radicaux :

  • ont une durée de vie courte (< 1 ms)
  • un petit rayon de marquage (< 20 nm)
  • peuvent former des liaisons covalentes avec les acides aminés riches en électron comme Tyr, Trp, His et Cys
  • ont une propriété capitale : ils ne traversent pas la membrane mitochondriale. Ils ne marquent donc que les protéines de la matrice ou les régions exposées vers la matrice des protéines de la membrane interne.

Le marquage covalent est fait par l'addition de [biotine (B) - phénol] et de H2O2. Les cellules sont ensuite lysées et les protéines biotinylées sont récupérées avec des billes sur lesquelles est fixée la streptavidine. Les protéines sont ensuite éluées, séparées sur gel et identifiées par spectromètrie de masse.

proteome matrice mitochondriale inner outer matrix mitochondria biotin biochimej

Source : Rhee et al. (2013)

Cette étude a permis :

  • d'identifier 495 protéines de la matrice mitochondriale dont 464 étaient déjà annotées "mitochondrie". Ainsi 31 protéines qui n'étaient pas annotées sont désormais associées à la mitochondrie ou à la matrice mitochondriale.
  • d'améliorer l'annotation de 240 protéines en spécifiant leur localisation sub-mitochondriale matricielle.
  • d'associer à la matrice mitochondriale 6 protéines dont on pensait qu'elles étaient localisées dans la membrane externe ou dans l'espace intermembranaire.

proteome matrice mitochondriale inner outer matrix mitochondria biotin biochimej

Source : Rhee et al. (2013)

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4. Formalisme décrivant les vitesses des réactions d'un sytème

1er exemple

Matrice stoechiometrique stoichiometric matrix reaction rate flux balance biochimej

Pour l'ensemble du système, on a la relation :

Matrice stoechiometrique stoichiometric matrix reaction rate flux balance biochimej

  • V est le vecteur des vitesses
  • S est la matrice des coefficients stoechiomètriques
  • v est le vecteur des lois de réactions

Qui s'écrit dans le cas du système des 2 réactions R1 et R2 :

Matrice stoechiometrique stoichiometric matrix reaction rate flux balance biochimej

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2ème exemple

Matrice stoechiometrique stoichiometric matrix reaction rate flux balance biochimej

Qui s'écrit :

Matrice stoechiometrique stoichiometric matrix reaction rate flux balance biochimej

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5. La matrice de stoechiomètrie S ("S-matrix" ou "Stoichiometric matrix")

Elle permet d'établir une relation linéaire, donc mathématiquement simple, entre :

  • la vitesse de flux ("flux rate" ) des réactions enzymatiques
  • et la variation de la concentration des substrats (réactants) en fonction du temps

Par convention :

  • les lignes de la matrice correspondent aux métabolites (réactants) impliqués dans chacune des réactions : 1 ligne pour chaque métabolite
  • les colonnes correspondent aux réactions du système : 1 colonne pour chaque réaction
  • les coefficients stoechiomètriques sont négatifs s'il s'agit du substrat (puisque consommé)

Exemple matrice stoechiometrique stoichiometric matrix reaction rate flux balance genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE

Source : Durot et al. (2009)

Exemple simple de la construction d'une matrice de stoechiométrie N : on établit une liste de gènes qui codent les enzymes qui catalysent les réactions ν1, ν2 et ν3 impliquant les métabolites M1, M2, M3 et M4 (partie i figure ci-dessous).

Construction matrice stoechiometrique flux balance stoichiometric matrix reaction rate genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE

Source : Weckwerth (2011)

  • Ces réactions enzymatiques correspondent à la voie métabolique décrite dans la partie (ii).
  • La matrice de stoechiométrie N est obtenue à partir de cette liste de gènes et de la voie métabolique prédite.
  • Les vitesses de réactions rMi de transformation des métabolites sont exprimées sous la forme du produit : rMi = N . vecteur de flux (partie iii).

Modéliser l'ensemble des évènements intra- et extra-cellulaires, surtout chez les Eucaryotes, est donc d'une extrême compléxité. Les modèles actuels ne tiennent pas (encore) compte de tous les mécanismes qui régulent le métabolisme et, à une plus grande échelle, l'ensemble des processus cellulaires.

Quelques exemples traduisent la complexité des paramètres dont il faut tenir compte pour essayer de "simuler" une cellule in silico :

  • les différents types de transports (actif - hydrolyse de l'ATP, passifs via des canaux, ...)
  • les compositions (donc les propriétés physico-chimiques) très différentes des membranes propres à chaque compartiment sub-cellulaire
  • l'épissage alternatif et donc les différences de taux des différents transcrits d'un même gène (rôle des facteurs de transcription)
  • le taux de transcrits qui sont réellement traduits (phénomène d'interférence ARN, par exemple)
  • la modulation de l'activité des enzymes (à régulation allostérique ou sujettes à différents types d'inhibition)
  • les différents génomes (nucléaire, mitochondrial, chloroplastique) qui codent pour des protéines adressées à différents compartiments sub-cellulaires
  • la très large gamme de temps de demi-vie des macromolécules biologiques
  • les dizaines de milliers de réactions dans une cellule Eucaryote
  • ... (la liste est très longue)

A cela s'ajoute les limites (toujours repoussées) qu'imposent la puissance de stockage et de calcul des ordinateurs.

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6. Les modèles de reconstruction métabolique sous contraintes

a. Introduction

Le formalisme des vitesses des réactions enzymatiques peut-être une expression complexe de [la concentration des métabolites x constantes de vitesse des réactions].

De plus ces vitesses sont en permanence modulées par les processus de régulation :

  • régulation de la transcription des gènes
  • régulation de la traduction en enzymes
  • régulation de la synthèse des substrats, des produits, des molécules effectrices de l'activité de ces enzymes (le métabolisme)
  • régulation du transport des métabolites
  • ...

Décrire par le détail les équations qui traduiraient ces deux parties (cinétique enzymatique et processus de régulation) est une gageure tant sur le plan mathématique qu'en ce qui concerne le nombre de données requises. Et ce d'autant que l'on a aucune certitude de disposer de manière exhaustive de ces données. Pour s'en convaincre, il suffit de regarder ce que l'on connait du métabolisme de base. On mesure la complexité inouie des modèles qu'il faudrait développer.

En pratique, à ce jour, on restreint donc la modélisation cinétique des réseaux métaboliques d'une "cellule entière" à des modèles plus "petits" qui incluent des miliers de réactions (d'enzymes) et de métabolites, associés à autant de gènes.

Ainsi, les modèles du métabolisme sous contraintes contournent ces limitations en focalisant sur la moyenne des vitesses des réactions qu'atteint la croissance cellulaire dans un environnement stable - dit stationnaire - ou évoluant trés lentement.

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b. L'état stationnaire

La notion d'état stationnaire est capitale. Cette approximation est justifiée en regard de la différence d'échelles de temps trés différentes :

  • macroscopiquement, le temps nécessaire à l'ensemble du métabolisme d'une cellule pour se stabiliser est supérieur à la minute et comparable au temps nécessaire pour l'internalisation de support nutritif et d'excrétion de déchets.
  • en revanche, microscopiquement, le temps nécessaire à une réaction enzymatique pour atteindre l'état stationnaire est très largement inférieur à la minute.
  • de plus, puisque les changements environnementaux et les variations de concentrations en enzymes s'échelonnent eux-aussi sur des échelles de temps longues, il n'est pas nécessaire de prendre en compte les aspects liés aux processus de régulation dans les modèles sous contraintes.

En d'autres termes : la vitesse de renouvellement des métabolites étant trés élevée à l'échelle de temps considéré (la minute), on peut considérer que leur concentration a atteint l'état stationnaire et qu'elle est alors constante tant qu'il n'y a pas de variation de l'environnement.

En conséquence, pour simplifier les modèles :

  • on s'appuie sur le fait que l'état métabolique d'une cellule et sa variation dans le temps peuvent être décrits par la concentration des métabolites et la vitesse des réactions.
  • ces quantités sont liées par la loi de la conservation de la matière : la vitesse de production nette d'un métabolite est égale à la somme des vitesses des réactions qui le consomment et des vitesses des réactions qui le produisent, pondérées par les coefficients stoechiomètriques associés à chaque réaction.
  • cette loi contraint la consommation et la production à être équilibrée ( le terme anglo-saxon est "balanced") : c'est ce que l'on appelle l'hypothèse du quasi-équilibre.
  • la contrainte sur les vitesses de réaction s'apelle la contrainte d'équilibre des masses ou contrainte stoechiométrique des masses ("mass balance constraint").

Ainsi, à l'état stationnaire :

α. Pour chaque métabolite d'un tel système "équilibré", on peut écrire une expression mathématique simple de la contrainte d'équilibre des masses qui met en jeu la vitesse des réactions : ∑ Si . νi = 0

  • Si est le coefficient stoechiométrique du métabolite i impliqué dans la réaction i
  • νi est la vitesse de cette réaction i avec νi ≥ 0, ∀ i
  • Pour peu que l'on ait des valeurs précises des vitesses des réactions, on peut imposer des bornes de valeurs à ces vitesses : αi ≤ νi ≤ βi

Exemple :

  • - ν1 + ... = 0
  • ν1 - ν2 + ... = 0
  • ν1 - 2 ν2 + ... = 0
  • ν2 + ... = 0

β. La vitesse de croissance de la biomasse de la cellule (νbiomasse) doit être maximisée : z = cT

  • z est la fonction objectif (voir ci-dessous)
  • c est le vecteur de pondération qui indique la contribution de chaque réaction à la fonction objectif

Remarques :

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c. L'analyse de la balance des flux dans les grandes voies métaboliques

Un flux est la vitesse de transformation d'un métabolite dans une voie métabolique.

En absence de contrainte (figure a, ci-dessous), les valeurs des flux peuvent se trouver en tous points d'un espace de solutions.

Metabolomique metabolomics modele reconstruction metabolique echelle genome flux balance analysis constraint contrainte genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE biochimej

Source : de Oliveira Dal'Molin & Nielsen (2013)

Figure b : l'introduction de diverses contraintes restreint l'espace total des solutions à un sous-espace de solutions permises ou possibles (cône de la figure b).

  • le bilan des masses (la conservation de la matière) : contrainte imposée par la stoechiométrie S
  • la réversibilité : νi ≥ 0, ∀ i, avec νi = vitesse d'une réaction i
  • la capacité : νi ≤ νMax
  • des conditions physiologiques spécifiques sont des contraintes typiques. Par exemple, une feuille qui effectue la photosynthèse en produisant de la biomasse d'une composition connue, avec un taux de croissance connu.

En raison de ces contraintes, le flux global dans le réseau peut avoir toute valeur au sein de ce cône de solutions. Les valeurs en dehors de cet espace ne respectent pas la conservation de la matière et sont par conséquent éliminées.

Figure c : grâce à l'optimisation de fonctions objectif, l'analyse de la balance des flux permet de calculer une distribution de flux optimale unique qui se trouve aux bords de l'espace des solutions admissibles (surface de Pareto).

Remarques :

  • Optimisation de fonctions objectif :
    1. maximiser la formation de biomasse
    2. maximiser la formation d'ATP
    3. minimiser le flux des réaction au sein de la voie métabolique
  • Des méthodes plus récentes ("Markov chain Monte Carlo (MCMC) sampling") essayent de s'affranchir de l'hypothèse de croissance cellulaire optimale qui introduit un biais.
  • Voir : Bordbar et al. (2014) "Constraint-based models predict metabolic and associated cellular functions" Nat. Rev. Genet. 15, 107-120

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d. Exemples de fonctions objectif pour les modèles sous contraintes

Les équations stoechiométriques contiennent davantage de flux inconnus que les équations de balance des masses : il existe donc un très grand nombre de solutions pour chaque modèle de reconstruction (il n'y a pas de solution unique pour la distribution des flux).

On émet donc certaines hypothèse concernant le métabolisme (supposé être régulé) : l'objectif le plus évident du métabolisme est une croissance maximale de l'organisme.

Exemples de fonctions objectif implémentées dans des modèles de reconstruction sous contraintes (méthode "Flux Balance analysis" - FBA) :

  • fonction objectif : maximisation du rendement de biomasse => max (νbiomasse / νglucose) (ν désigne le flux)
  • signification : l'évolution dirige la sélection des espèces vers un rendement maximal de biomasse
  • fonction objectif : maximisation du rendement en ATP => max (νATP / νglucose)
  • signification : l'évolution dirige la sélection des espèces vers une efficacité énergétique maximale

Autres exemples de fonctions objectif :

  • minimisation de la consommation de glucose => min (νglucose / νbiomasse)
  • minimisation du flux intracellulaire global
  • maximisation du rendement en ATP par réaction y => min (νATP / ∑ y2i), y € {0,1}
  • un rapport P/O = 1 (une molécule d'ATP générée par molécule de NADH à l'issue de la phosphorylation oxydative). Valeur basée sur le niveau de transcription des gènes et l'efficacité de couplage connus des complexes de la chaîne respiratoire
  • consommation d'oxygène couplée à la vitesse d'absorption du glucose à une stoechiométrie précise / une limite supérieure précise de la consommation d'oxygène

Voir l'article Schuetz et al. (2007).

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e. La biomasse - la croissance - GAM et NGAM

Un modèle de reconstruction métabolique décrit en termes quantitatifs la conversion de mmoles de substrats en gramme de poids sec de cellules c'est-à-dire la biomasse.

Par définition, la biomasse produite doit avoir un poids moléculaire de 1 g.mmole-1 afin de comparer de manière quantitative la formation de la biomasse avec les rendements de croissance observés ou les vitesses de croissance spécifiques.

Il existe plusieurs sources d'erreurs dans l'analyse des réactions qui créent la biomasse :

Non-growth associated ATP maintenance requirement requis en absence de croissance genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE contrainte constraint biochimej

Source : Chan et al. (2017)

  • 1a. Les réactions décrites par certaines plates-formes boinformatiques qui proposent des modèles automatisées.
  • 1b. Les réactions adaptées d'autres modèles avec des composants de la biomasse qui sont soit supprimés (Bio5), soit ajoutés.
  • 2. Des coefficients stoechiométriques inexacts (Bio3 et Bio4) en partie à cause de groupes chimiques non définis (exemples : R et X).
  • 3. L'absence de cofacteurs dans les réactions. Exemples : les protons pour la synthèse des macromolécules, l'eau pour la synthèse des protéines et le pyrophosphate (PPi) pour la synthèses d'ADN et d'ARN.

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GAM et NGAM

Les organismes effectuent des réactions cataboliques pour générer l'énergie nécessaire à leur croissance et à l'entretien des cellules. Cette énergie est traduite par deux paramètres :

  • la maintenance associée à la croissance (« Growth Associated Maintenance » - GAM) qui représente l'énergie nécessaire pour la polymérisation des macromolécules telles que l'ADN, l'ARN, les protéines et le glycogène, pendant la croissance.
  • la maintenance non-associée à la croissance (« Non-Growth Associated Maintenance » - NGAM) qui représente la quantité d'ATP dont a besoin toute cellule hors croissance. Il s'agit donc de l'énergie consommée par l'ensemble des processus autres que la formation de nouveau matériel cellulaire (la réparation cellulaire, la motilité, l'entretien des gradients d'ions, …).
  • Les flux de réactions étant normalisés par la masse sèche des cellules, l'unité de GAM et NGAM est : mmole.h-1.g-1 de matière sèche (en anglais : "mmol.h-1.g-1 dry weight" ou "mmol.h-1.g-1 DW"). Exemples :
    1. L'énergie de maintien pendant la phase de croissance exponentielle de Escherichia coli = 7,6 - 8,4 mmol ATP.h-1.g-1de matière sèche.
    2. Bactérie Geobacter metallireducens : GAM = 79.20 mmole.h-1.g-1 et NGAM = 0.81 mmole.h-1.g-1.

La GAM et la NGAM peuvent être déterminées directement avec le graphique des données de croissance obtenues à partir des expériences avec un chemostat.

Non-growth associated ATP maintenance requirement requis en absence de croissance genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE contrainte constraint

Source : Thiele & Palsson (2010)

Exemple : maximisation du renouvellement en ATP sous une contrainte d'absorption du glucose de 1 mmol.h-1.g-1de matière sèche (figure ci-dessous).

Non-growth associated ATP maintenance requirement requis en absence de croissance genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE contrainte constraint

Source : Chung et al. (2010)

  • La quantité d'ATP nécessaire est évaluée à : Qmax = 21.5 mol ATP.mol-1 glucose.
  • Sur la base de cette valeur et du point d'intersection avec l'axe des ordonnées (0.105 mmol glucose.h-1.g-1de matière sèche), on calcule : NGAM # 2,26 mmol ATP.h-1.g-1de matière sèche.

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f. Exemples de méthodes d'analyse des modèles de reconstruction métabolique sous contraintes

Descriptions de quelques théories et concepts

Article : Bennett et al. (2009) "Absolute Metabolite Concentrations and Implied Enzyme Active Site Occupancy in Escherichia coli" Nat. Chem. Biol. 8, 593 - 599

  • Metabolomic Flux Analysis (MFA)
  • Thermodynamics-Based Metabolomic Flux Analysis (TMFA)
  • Network-embedded thermodynamic analysis (NET)

Ces théories permettent d'établir un lien entre la concentration des métabolites et la direction du flux métabolique.

En effet, le sens de n'importe quelle réaction du métabolisme est dictée par la variation d'énergie libre de Gibbs (ΔG'réaction) qui lui est associée. Or celle-ci dépend exclusivement des concentrations intracellulaires (physiologiques / [X]φ) des métabolites impliqués dans cette réaction. Les concentrations [X]éq sont celles qui décrivent le système quand l'équilibre est atteint dans les conditions standards.

Construction matrice stoechiometrique flux balance stoichiometric matrix reaction rate genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE

L'une des techniques les plus performantes pour mesurer les concentrations d'un trés grand nombre de métabolites est la spectromètrie de masse (par exemple : "liquid chromatography-tandem mass spectrometry"), combinée au marquage par des radioéléments.

Article : Henry et al. (2007) "Thermodynamics-based metabolic flux analysis" Biophys. J. 92, 1792 - 1805

L'analyse de la balance des flux ("Flux balance analysis" - FBA)

Cette approche ne nécessite pas de connaitre la concentration des métabolites ni le détail des cinétiques enzymatiques du système.

L'hypothèse est que le système étudié est homéostatique. Le question à résoudre dés lors s'énonce de la manière suivante : compte-tenu de nutriements disponibles, quel ensemble de flux métaboliques maximise la vitesse de croissance de l'organisme tout en préservant la concentration intracellulaire des métabolites ?

Autres méthodes d'analyse

  • Price et al. (2003) : "Singular Value Decomposition (SVD) of extreme pathways"
  • "Elementary mode of extreme pathways" (proche de la méthode SVD) : c'est le plus petit sous-réseau métabolique d'un réseau donné qui de fonctionner à l'état stationnaire.
  • Larhlimi & Bockmayr (2008) : "Minimal metabolic behaviors for the analysis of metabolic networks"
  • Lee et al. (2008) : "integrated dynamic Flux Balance Analysis" (idFBA)
  • Yizhak et al. (2010) : "Integrative omics-metabolic analysis method" (IOMA)

Voir une liste de méthodes dite COBRA ("COnstraint-Based Reconstruction and Analysis").

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7. Etude du contrôle du métabolisme glucidique lié au diabète de type 2

Figure ci-dessous : schéma synoptique de la méthode d'identification de métabolites rapporteurs et des motifs de séquences régulatrices associées.

diabete type 2 genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE

Source : Zelezniak et al. (2010)

Figure A : Système de score pour l'identification de métabolites rapporteurs, basé sur les scores des réactions enzymatiques associées.

Pour chaque enzyme, un score est aussi calculé sur la base de la "p-value" de la séquence nucléotidique du gène correspondant. Dans le cas de réactions catalysées par un complexe enzymatique ou un ensemble d'isoformes d'une même enzyme, la valeur minimale de la "p-value" de ces enzymes est retenue.

  • chiffres en gras : "Z-score" pour chaque réaction
  • autres chiffres : "p-value"

Figure B : Identification des motif de fixation des facteurs de transcription. Pour un métabolite rapporteur, un ensemble de gènes homologues codant des enzymes qui sont sur- ou sous-exprimés est sélectionné.

Les régions promotrices et les motifs situés en amont des sites de démarrage de la transcription ("transcription start site - TSS") de chaque gène sélectionné sont annotés selon leur teneur en motifs de fixation des facteurs de transcription ("TF").

Signatures métabolique et régulatrice des diabètes de type 2

genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE diabete type 2

Source : Zelezniak et al. (2010)

Légende : CDP-choline, cytidine diphosphate choline; G1P, glucose 1-phosphate; G6P, glucose 6-phosphate; GSK3, glycogen synthase kinase-3; IRE1, inositol requiring kinase-1; LC-CoAs, long-chain acyl CoAs; PA, phosphatidate; PH, pleckstrin homology domain;PI, phospatidylinositol; PIP, phospatidylinositol 4-phospate; PIP2, phosphatidylinositol 4,5-bisphospate, PIP3, phospatidylinositol 3,4,5-trisphospate; PTB, phosphotyrosine binding domain; RXR, retinoid X receptor; SH2, src homology domain; TF, transcription factor; CPT1, carnitine palmitoyltransferase-1; PTDETN, phosphatidylethanolamine.

Les métabolites rapporteurs appartenant aux voies clés de la régulation des diabètes de type 2 sont écrits en gras.

  • flèches et encarts en gris : hypothèses ou résultats antérieurs à l'étude de Zelezniak et al.
  • lignes pleines : effets directs
  • lignes pointillées : effets indirects

Une sur-alimentation chronique et un manque d'activité physique augmentent l'entrée d'acides gras, ce qui induit la β-oxidation via l'activation des gènes médiée par le facteur activé de prolifération des peroxysomes (récepteur nucléaire - PPARα/δ - "peroxisome proliferator-activated receptor alpha and delta") sans qu'il y ait une augmentation coordonnée du flux du cycle des acides tricarboxyliques (TCA).

Une conséquence possible est l'accumulation dans les mitochondries de dérivés de métabolites (exemples : acylcarnitines ou molécules réactives dérivées de l'oxygène - "reactive oxygen species - ROS") issus d'une β-oxidation incomplète.

Ces stress pourrait induire une "surcharge mitochondriale" qui, de concert avec des molécules lipidiques de signalisation (exemple : le dyacylglycérol - DAG) enclencheraient une cascade impliquant des (Ser/Thr) protéines kinases, cascade qui serait initiée par une nouvelle protéine kinase nPKCs ("novel protein kinase Cs").

Il en résulte une phosphorylation des sites (Ser/Thr) du substrat 1 du récepteur de l'insuline (IRS-1) qui a pour conséquences :

  • l'inhibition de la phosphorylation des sites Tyr de IRS-1
  • l'activation de la phosphoinositol 3-kinase (PI 3-kinase)

Ces 2 évènements entravent la translocation du transporteur du glucose de type 4 (GLUT4) ce qui diminue le transport du glucose et donc la synthèse du glycogène.

Une augmentation de l'activité physique ou le jeûne activent la protéine PGC1α (co-activateur 1α du récepteur nucléaire PPARγ) et la protéine CREB ("cAMP response element binding protein"), un activateur puissant de PGC1.

Ces évènements atténuent le effets du stress lipidique en augmentant le flux du TCA et en couplant l'activité induite par la fixation du ligand sur PPARα/δ avec le remodelage médié par PGC1α des voies métaboliques situées en aval telles que la respiration et la β-oxidation.

Voir des applications en biotechnologies industrielles et médicales.

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8. La base de données de modèles biologiques "Biomodels" (EBI)

Voir un cours sur la régulation du métabolisme.

  • Aller à la base de données BioModels Database.
  • Cliquer sur le lien : "Gene Ontology classification". Choisir la partie verte "Response to stimulus".
  • Rechercher le modèle "Wang2007 - ATP induced intracellular Calcium Oscillation" : BIOMD0000000145

Figure ci-dessous : modèle proposé par Wang et al. (2007) - "A quantitative kinetic model for ATP-induced intracellular Ca2+ oscillations" J. Theor. Biol. 245, 510 - 519.

Modele oscillation calcique genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE BioModels database biochimej

Variables du modèle :

  • [Gα-GTP] : concentration du complexe entre le GTP et la sous-unité Gα activée de la protéine G
  • [APLC] : concentration de la forme active de la PLC
  • [IP3] : concentration de l'IP3
  • [Ca2+]cyt : concentration du calcium dans le cytoplasme
  • [Ca2+]RE : concentration du calcium libre dans le RE

stoechiometric matrix modele oscillation calcique genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE

  • d[S]/dt est le vecteur des vitesses
  • N est la matrice des coefficients stoechiomètriques
  • v est le vecteur des lois de réactions

Voir une analyse détaillée de ce modèle.

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a. Quel type de signal ce modèle essaye-t-il de modéliser ?

b. Faire le lien entre les informations contenues dans l'onglet "Math" et le modèle décrit ci-dessus.

c. Dans le menu déroulant "Actions" :

  • Choisir : "View Bitmap Recation Graph". Faire le lien entre le modèle obtenu et les informations contenues dans l'onglet"Math".
  • Choisir : "View Dynamic Reaction Graph" (Applet java) pour visualiser le réseau d'interactions. Les différentes interactions sont obtenues en cliquant sur les composés du modèle.
  • Choisir : "BioModels Online Simulation" pour visualiser la simulation de la cinétique d'évolution du modèle.

d. Quelle information obtient-on dans l'onglet «Physical entities» ?

e. Aller à : "Models of the month".

March 2010, model of the month - C. Hoyer : Borisov et al. (2009) "Systems-level interactions between insulin-EGF networks amplify mitogenic signaling" Mol Syst Biol. 5, 256

Quelques mots clés : "Epidermal growth factor / Insulin / EGF receptors (EGFR) / Insulin receptor / receptor tyrosine kinases"

Cet article illustre le modèle : BIOMD0000000223 - Borisov 2009 EGF Insulin Crosstalk

 

9. Liens Internet et références bibliographiques
  • GOLD : "Genomes OnLine Database"
  • metaTIGER : base de données de voies métaboliques et d'informations phylogénomiques pour un trés grand nombre d'eucaryotes.
  • KEGG pathways : base de données de voies métaboliques
  • BioCyc : Bases de données voies métaboliques (EcoCyc, MetaCyc, AraCyc, YeastCyc)
  • MetaRoute : "web interface for interactive navigation through genome-scale networks and local network visualization"
  • BioModels Database : "A Database of Annotated Published Models"
  • BiGG : "Repository of reconstructed genome-scale metabolic models"
  • The Human metabolome project
  • KBase : The U.S. Department of Energy Systems Biology Knowledgebase

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