Métabolomique : modèles de reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome
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1. Introduction

a. Généralités

b. Illustration de l'élaboration d'un modèle de reconstruction métabolique

c. L'analyse de la balance des flux dans les grandes voies métaboliques ou réseaux

d. Illustration d'une meilleure annotation pour l'amélioration d'un modèle de reconstruction

2. Exemple de démarche pour l'élaboration de modèles de reconstruction métabolique

3. Formalisme élémentaire décrivant les vitesses des réactions d'un sytème

 

4. La matrice de stoechiomètrie S

5. Les modèles métaboliques sous contraintes

6. Vérification de la robustesse des modèles

7. Les méthodes d'analyse des modèles

8. Exemples d'études et d'applications

9. La base de données de modèles : "Biomodels" - EBI

10. Liens Internet et références bibliographiques

 

1. Introduction

a. Généralités

De plus en plus de génomes sont séquencés ou en cours de séquenage. Voir les bases de données suivantes :

Les modèles du métabolisme l'échelle d'un génome établissent le pont entre les informations issues du séquenage de ce génome (et des analyses subséquentes de ce génome), les données biochimiques et métaboliques et les phénotypes liés ce métabolisme.

Cette démarche dite "métabolomique" est récente car elle est la conséquence logique de tous les domaines antérieurs en "omique".

domaine omique metabolomics genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE stoichiometric matrix matrice stoechiometrie reaction rate flux balance biochimej

Terminologies anglo-saxonnes : "Genome-scale metabolic reconstruction", "Metabolic network reconstruction", "Genome-scale measurement, modelling and predicting of dynamic metabolic networks", acronyme "GENRE" = "GEnome-scale Network REconstruction", ...

Le NIH ("National Institutes of Health") a annoncé un investissement de 14,3 millions de dollars en 2012 (et probablement 51,4 millions de dollars sur 5 ans) pour le développement de la métabolomique.

L'accroissement du nombre de modèles du métabolisme l'échelle d'un génome

Pour l'homme :

La figure ci-contre montre le nombre croissant de modèles de reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome.

  • orange : eukaryotes
  • bleu : prokaryotes
  • vert : archaea

Le nombre de modèles croit exponentiellement : 30% des modèles ont été construits depuis 2010.

Un nombre croissant de modèles d'Eucaryotes (beaucoup plus complexes) sont construits.

Parmi eux, on notera 3 plantes :

Source : Kim et al. (2012)

modele reconstruction echelle genome genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE biochimej

La figure ci-contre montre le nombre cumulé de modèles du métabolisme à l'échelle d'un génome ("GEnome-scale Network REconstruction" - GENRE).

modele reconstruction echelle genome genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE biochimej

Source : Monk et al. (2014)

La figure b indique le nombre d'enzymes annotées selon leur numéro EC ("Enzyme commission") intégrées dans les modèles.

Voir : "Whole genome metabolism models available" - BioModels Database.

Ainsi, la métabolomique intègre l'ensemble des données issues (liste non exhaustive) :

  • du séquençage des génomes et détermination de leur structure (génomique structurale)
  • de l'expression spatio-temporelle des gènes (génomique fonctionnelle)
  • du taux spatio-temporel réel des ARN messagers (transcriptomique)
  • du taux spatio-temporel réel de protéines (protéomique)
  • des bases de données de voies métaboliques : KEGG pathways, KEGG genes & proteins, BioCyc (EcoCyc, MetaCyc, AraCyc, YeastCyc, ...)
  • des bases de données généralistes (recueil d'informations) sur les gènes, les ARN messagers, les protéines, les métabolites et autres (NCBI, EBI, Uniprot, TransportDB , ...)
  • des bases de données sur les enzymes : réactions catalysées, paramètres cinétiques, substrats, produits, co-facteurs, effecteurs et autres (Brenda, Enzyme , ...)
  • des bases de données d'annotation des gènes et des protéines : Gene Ontology, KAAS (KEGG Automatic Annotation Server), DAVID , ...
  • des bases de données de la littérature scientifique :NCBI PubMed, ...
  • des données biochimiques accumulées depuis des décennies : décryptage des voies métaboliques, données thermodynamiques (en particulier ΔG' des réactions), concentration des métabolites, vitesse des réactions enzymatiques, paramètres cinétiques des enzymes ...

Metabolomique metabolomics genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE

La métabolomique nécessite donc de fouiller ("data mining") une quantité colossale de données et, bien souvent, de les nettoyer (les "curer" - curators).

Ce travail méticuleux, extrêmement gourmand en temps est laborieux et systématique.

Les nouvelles données attendues sont une "sur-information" déduite de l'analyse de l'ensemble de ces informations de base.

  • données concernant les possibilités métaboliques d'une cellule (ou d'un organisme) s'adapter / évoluer dans tel environnement : un lien est alors établi entre le génome, le métabolisme et le phénotype.
  • précision concernant l'histoire évolutive d'une cellule (ou d'un organisme).
  • confirmation ou infirmation du rôle majeur de telle réaction enzymatique dans la régulation du flux de telle voie métabolique.
  • confirmation ou infirmation des corrélations établies entre gènes, enzymes et réactions catalysées.
  • mise en évidence de maillons métaboliques manquants : enzymes ou métabolites qui n'auraient pas été identifiés mais dont l'existence s'impose sur la base du bon fonctionnement des modèles.
  • comparaison de métabolisme intra- et inter-espèces : cette partie est la plus difficile car il faut avoir des modèles reconstruits pour les espèces comparées et ces modèles doivent être construits avec les mêmes nomenclatures, formalismes et structures de fichiers.
  • enfin et non des moindres : modification et améliorations d'espèces par ingénièrie ("knockout", accroissement de la transcription de gènes par "familles de facteur de transcription", ingénièrie des protéines, insertion de synthèse dans une voie métabolique, modifications de flux métabolique, ...). Par exemple, en mutant la séquence d'un promoteur constitutif, Alper et al. (2005) ont construit une banque de promoteur de différentes forces permettant de moduler la vitesse de transcription d'un même gène au niveau désiré selon le promoteur inséré en amont. Cela permet de contrôler la vitesse de transcription de toutes les enzymes d'une voie métabolique afin d'en optimiser le flux.

La démarche de reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome est itérative : la comparaison avec la réalité biologique permet d'ajuster le modèle et de le re-confronter aux données réelles et ainsi de suite, afin de l'améliorer (voir la figure 1 de Balagurunathan et al. (2012)).

  • recensement du maximum d'informations de tous types pour élaborer un modèle de base à affiner
  • création d'un premier modèle de reconstruction métabolique à l'échelle du génome de l'organisme étudié
  • de manière conjointe :
    1. analyse bioinformatique du modèle de reconstruction
    2. mesures des paramètres biochimiques et physiologiques réels qui rendent compte d'une croissance optimale de l'organisme

modele reconstruction metabolique echelle genomemodele reconstruction metabolique echelle genome genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENREmodele reconstruction metabolique echelle genome

  • comparaison des résultats prédits par le modèle avec les mesures réelles
  • le modèle est affiné : intégration ou élimination (sophistication) de données

Le processus de reconstruction recommence.

Source : Lewis et al. (2012)

modele reconstruction metabolique echelle genome genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE

La métabolomique s'appuyant massivement sur des méthodes bioinformatiques, elle est trés largement prédictive. Mais elle permet d'orienter de futures expériences dans des voies prometteuses et épargne un temps précieux de recherche au hasard.

Bien évidemment, il existe une étape clé: la confrontation de ces modèles avec la réalité biologique. Cette étape est d'autant plus importante que les modèles peuvent être modifiés, améliorés comme tout système d'apprentissage.

Remarques :

  • beaucoup de termes anglo-saxon n'ont pas une traduction "évidente" et claire
  • il y a un emploi important d'acronymes en métabolomique
  • de nouveaux mots en "omique" font leur apparition, sans qu'ils aient un sens réel tant que les domaines afférant n'ont pas été pleinement développés ("fluxomique" - étude de l'ensemble des flux métaboliques, "réactomique" et pourquoi pas ... "cellulomique").

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b. Illustration de l'élaboration d'un modèle de reconstruction métabolique

Figure A (ci-dessous) : le 1er modèle dit "à plat"

  • Les métabolites (cercles vert et noirs), les réactions enzymatiques (Ex) et les transporteurs (Tx) sont extraits de l'annotation du génome et de différentes bases de données.
  • Le cercle vert S (en haut à gauche) représente l'entrée d'un substrat initial dans la voie métabolique et les cercles bleus représentent les produits (P1 à P5) en dehors (à priori) de cette voie métabolique.
  • Les couleurs (noire et verte) des réactions enzymatiques indiquent que plusieurs gènes codent la même enzyme (exemple : E10 et E37).
  • Les points d'interrogation sont des exemples de lacunes ("gap") qui imposent une amélioration de ce 1er modèle afin de combler ces lacunes ("gap filling") et déboucher sur une analyse in silico réaliste et efficace, c'est-à-dire dont on peut tirer des informations.

Metabolomique metabolomics modele reconstruction metabolique echelle genome genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE iterative procedure

Source : Gomes de Oliveira Dal'Molin & Nielsen (2013)

Figure B : amélioration du 1er modèle

  • La recherche ou l'obtention (expérimentale) de nouvelles informations permet d'introduire la compartimentation qui sépare la glycolyse cytosolique et la glycolyse plastidique du cycle de Krebs dans les mitochondries.
  • La compartimentation permet aussi d'allouer les enzymes aux différents organites.
  • iI en découle la nécessité de transporteurs (T1 à T5, jusqu'à lors non mis en évidence) pour permettre le transport de métabolites entre organites.
  • De nouvelles réactions enzymatiques (jusqu'à lors non mises en évidence) peuvent être également proposées (E13 et E16).

c. L'analyse de la balance des flux dans les grandes voies métaboliques ou réseaux

Un flux est la vitesse de transformation d'un métabolite dans une voie métabolique.

En absence de contrainte (figure a, ci-dessous), les valeurs des flux peuvent se trouver en tous points d'un espace de solutions.

Metabolomique metabolomics modele reconstruction metabolique echelle genome flux balance analysis constraint contrainte genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE

Source : de Oliveira Dal'Molin & Nielsen (2013)

Figure b : l'introduction de diverses contraintes restreint l'espace total des solutions à un sous-espace de solutions permises ou possibles (cône de la figure b).

  • le bilan des masses (la conservation de la matière) : contrainte imposée par la stoechiométrie S
  • la réversibilité : νi ≥ 0, ∀ i, avec νi = vitesse d'une réaction i
  • la capacité : νi ≤ νMax
  • des conditions physiologiques spécifiques sont des contraintes typiques : par exemple, une feuille qui effectue la photosynthèse en produisant de la biomasse d'une composition connue, avec un taux de croissance connu

En raison de ces contraintes, le flux global dans le réseau peut avoir toute valeur au sein de ce cône de solutions. Les valeurs en dehors de cet espace ne respectent pas la conservation de la matière et sont par conséquent éliminées.

Figure c : grâce à l'optimisation de fonctions objectif, l'analyse de la balance des flux permet de calculer une distribution de flux optimale unique qui se trouve aux bords de l'espace des solutions admissibles (surface de Pareto).

Remarques :

  • Optimisation de fonctions objectif :
    1. maximiser la formation de biomasse
    2. maximiser la formation d'ATP
    3. minimiser le flux des réaction au sein de la voie métabolique
  • Des méthodes plus récentes ("Markov chain Monte Carlo (MCMC) sampling") essayent de s'affranchir de l'hypothèse de croissance cellulaire optimale qui introduit un biais.
  • Voir : Bordbar et al. (2014) "Constraint-based models predict metabolic and associated cellular functions" Nat. Rev. Genet. 15, 107-120

d. Illustration d'une meilleure annotation pour l'amélioration d'un modèle de reconstruction

Les méthodes traditionnelles pour les études protéomiques d'organites se traduisent souvent par une spécificité limitée des protéines étudiées, la perte de matériel biologique et d'éventuelles contaminations du fait des étapes d'isolement des organites et de purification de leur contenu en protéines.

Une méthode récente permet de minimiser ces inconvénients : elle utilise un marquage spécifique des protéines de la matrice de la mitochondrie par la biotine, tandis que la cellule est vivante, avec toutes ses membranes et ses complexes protéiques intacts et que les relations spatiales entre les protéines sont préservées.

La méthode utilise une enzyme, l'ascorbate peroxidase (APEX), modifiée par ingénierie. L'APEX est spécifiquement adressée à la matrice mitochondriale par fusion à un peptide d'adressage de 24 acides aminés. Une fois dans la matrice mitochondriale, l'APEX marque par biotinylation (liaison covalente) les protéines voisines (mais pas les protéines lointaines) dans les cellules vivantes.

L'APEX est active dans tous les compartiments cellulaires et elle oxyde de nombreux dérivés du phénol en radicaux phénoxyl.

Ces radicaux :

  • ont une durée de vie courte (< 1 ms)
  • un petit rayon de marquage (< 20 nm)
  • peuvent former des liaisons covalentes avec les acides aminés riches en électron comme Tyr, Trp, His et Cys
  • ont une propriété capitale : ils ne traversent pas la membrane mitochondriale. Ils ne marquent donc que les protéines de la matrice ou les régions exposées vers la matrice des protéines de la membrane interne.

Le marquage covalent est fait par l'addition de [biotine (B) - phénol] et de H2O2. Les cellules sont ensuite lysées et les protéines biotinylées sont récupérées avec des billes sur lesquelles est fixée la streptavidine. Les protéines sont ensuite éluées, séparées sur gel et identifiées par spectromètrie de masse.

proteome matrice mitochondriale inner outer matrix mitochondria biotin

Source : Rhee et al. (2013)

Cette étude a permis :

  • d'identifier 495 protéines de la matrice mitochondriale dont 464 étaient déjà annotées "mitochondrie". Ainsi 31 protéines qui n'étaient pas annotées sont désormais associées à la mitochondrie ou à la matrice mitochondriale.
  • d'améliorer l'annotation de 240 protéines en spécifiant leur localisation sub-mitochondriale matricielle.
  • d'associer à la matrice mitochondriale 6 protéines dont on pensait qu'elles étaient localisées dans la membrane externe ou dans l'espace intermembranaire.

proteome matrice mitochondriale inner outer matrix mitochondria biotin

Source : Rhee et al. (2013)

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2. Exemples de démarche pour l'élaboration de modèles de reconstruction métabolique

Le premier pas est d'identifier l'ensemble des réactions, les métabolites impliqués et leur stoechiomètrie et les enzymes qui catalysent ces réactions.

Les techniques de mesures quantitatives les plus utilisées sont :

Les annotations fonctionnelles disséminées dans les bases de données doivent donc être compulsées, triées et les plus complètes possibles afin d'être traduites en un ensemble de réactions détaillées.

La classification EC ("Enzyme Commission") de "Enzyme" fournit un système non ambigu d'association entre enzymes et réactions catalysées.

Figure ci-contre, la démarche générale pour un travail de reconstruction métabolique l'échelle d'un génome.

"gap-analysis" : réaction qui ne débouche pas sur une autre réaction ("dead-end metabolites") ou réaction bloquée ("blocked reactions").

Voir Rolfsson et al. (2011) et la reconstruction de RECON 1.

Source : Oberhardt et al. (2008)

Modele regulation metabolisme genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE

Figure ci-contre, exemples d'outils pour la reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome.

Source : Pitkänen et al. (2010)

methode method genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE


Exemples d'algorithmes / programmes pour la reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome
RFBA : "Regulatory Flux Balance Analysis" EBA : "Energy balance analysis with Flux Balance Analysis"
SR-FBA : "Steady-state Regulatory Flux Balance Analysis" TMFA : "Thermodynamics-based Metabolic Flux Analysis"
GapFind/GapFill GrowMatch : "An Automated Method for Reconciling In Silico/In Vivo Growth Predictions"
GeneForce : "An Automated Phenotype-Driven Approach (GeneForce) for Refining Metabolic and Regulatory Models" SMILEY algorithm
TIGER : "Toolbox for integrating genome-scale metabolic models, expression data, and transcriptional regulatory networks"  

Exemples de bases de données pour la reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome
GOLD ("Genomes OnLine Database") : base de données de tous les génomes séquencés ou en cours de séquençage CMR ("Comprehensive Microbial Resource") : ensemble d'informations et de programme pour l'analyse des génomes de procaryotes
GeneCards : base de données de gènes de l'homme YMDB : "The Yeast Metabolome Database"
Enzyme : base de données de nomenclature des enzymes avec les N° EC associés Brenda : base de données d'enzymes
TCDB ("Transporter Classification Database") : protéines de transport membranaires BioCyc (contient les sous-bases de données EcoCyc (Escherichia coli K-12), AraCyc (Arabidopsis thaliana) , ...) : voies métaboliques et programmes pour les analyser
Pubchem : base de données de métabolites metaTIGER : base de données de voies métaboliques et d'informations phylogénomiques pour un trés grand nombre d'eucaryotes
IntAct : base de données d'interactions entre protéines STRING : "Known and Predicted Protein-Protein Interactions"
The Model SEED : "A resource for the generation, optimization, curation, and analysis of genome-scale metabolic models" MetaRoute : "web interface for interactive navigation through genome-scale networks and local network visualization"
ERGO : "Comparative analysis of genomes and generation of sophisticated metabolic and cellular reconstructions" KEGG ("Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes") : base de données pour l'étude des systèmes biologiques
Gene Ontology, DAVID , ... : annotation

KAAS (KEGG Automatic Annotation Server) : annotation

Les grandes bases de données généralistes : NCBI, EBI, Uniprot, PFAM, PDB, ...

Voir la traduction en langage SBML d'un modèle de reconstruction pour le maïs (C4GEM).

SBML : "Systems Biology Markup Language"

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3. Formalisme élémentaire décrivant les vitesses des réactions d'un sytème

1er exemple

Considérons les réactions R1 et R2, respectivement :

k1
A    ----------->   B
k2
2B   ----------->   C

La vitesse de la variation de la concentration de A s'écrit :  d[A]
---------  = - 1 . k1 . [A]
   dt
La vitesse de la variation de la concentration de B s'écrit :  d[B]
---------  = (+ 1 . k1 . [A]) + (- 2 . k2 . [B]2)
   dt
La vitesse de la variation de la concentration de C s'écrit :  d[C]
---------  = + 1 . k2 . [B]2
   dt
Pour l'ensemble du système, on a la relation : Matrice stoechiometrique stoichiometric matrix reaction rate flux balance
  • V est le vecteur des vitesses
  • S est la matrice des coefficients stoechiomètriques
  • v est le vecteur des lois de réactions

Qui s'écrit dans le cas du système des 2 réactions R1 et R2 :

Matrice stoechiometrique stoichiometric matrix reaction rate flux balance

2ème exemple

Considérons l'ensemble de réactions :

k1
A    ----------->   B
k2
   A + B   ----------->    A + C  
k3
   2B   ----------->    C  
k4
   C   ----------->    B  

Les équations différentielles associées à ces réactions s'écrivent :  d[A]
---------  = (- 1 . k1 . [A])
   dt
 d[B]
---------  = (+ 1 . k1 . [A]) + (- 1 . k2 . [A] . [B]) + (- 2 . k3 . [B]2) + (+ 1 . k4 . [C])
   dt
 d[C]
---------  = (+ 1 . k2 . [A] . [B]) + (+ 1 . k3 . [B]2) + (- 1 . k4 . [C])
   dt

Qui s'écrit :

Matrice stoechiometrique stoichiometric matrix reaction rate flux balance

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4. La matrice de stoechiomètrie S ("S-matrix" ou "Stoichiometric matrix")

Elle permet d'établir une relation linéaire, donc mathématiquement simple, entre :

  • la vitesse de flux ("flux rate" ) des réactions enzymatiques
  • et la variation de la concentration des substrats (réactants) en fonction du temps

Par convention :

  • les lignes de la matrice correspondent aux métabolites (réactants) impliqués dans chacune des réactions : 1 ligne pour chaque métabolite
  • les colonnes correspondent aux réactions du système : 1 colonne pour chaque réaction
  • les coefficients stoechiomètriques sont négatifs s'il s'agit du substrat (puisque consommé)

Exemple matrice stoechiometrique stoichiometric matrix reaction rate flux balance genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE

Source : Durot et al. (2009)

Exemple simple de la construction d'une matrice de stoechiométrie N

On établit une liste de gènes qui codent les enzymes qui catalysent les réactions ν1, ν2 et ν3 impliquant les métabolites M1, M2, M3 et M4 (partie i figure ci-contre).

Ces réactions enzymatiques correspondent à la voie métabolique décrite dans la partie (ii).

La matrice de stoechiométrie N est obtenue à partir de cette liste de gènes et de la voie métabolique prédite.

Les vitesses de réactions rMi de transformation des métabolites sont exprimées sous la forme du produit : rMi = N . vecteur de flux (partie iii).

Source : Weckwerth (2011)

Construction matrice stoechiometrique flux balance stoichiometric matrix reaction rate genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE

Complexité des phénomènes cellulaires

Figure ci-contre, un exemple (simplissime en regard de la réalité biologique) :

  • le gène 1 code pour une enzyme E1 qui transforme le métabolite M1 en M2 avec hydrolyse de l'ATP
  • E2 et E4 sont 2 isoformes codées par 2 gènes distincts (famille multigènique)
  • le gène 3 code pour 2 ARN messagers (épissage alternatif) donc 2 enzymes
  • E3 est modifiée post-traductionnellement
  • M4 rétro-inhibe E4
  • M4 et M5 (métabolite d'une autre voie) sont substrats de E5, issue d'un épissage alternatif du gène 3
  • ...

Systeme cellulaire complexe genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE biochimej

On imagine aisément l'extrême compléxité pour modéliser tous les évènements intra- et extra-cellulaires, surtout chez les Eucaryotes.

Les modèles actuels ne tiennent pas (encore) compte de tous les mécanismes qui régulent le métabolisme et, à une plus grande échelle, l'ensemble des processus cellulaires.

Il suffit de ne citer que quelques exemples pour se rendre compte de l'extrême complexité des paramètres dont il faudra tenir compte pour "simuler" une cellule in silico :

  • les mécanismes de transports (actif - hydrolyse de l'ATP, passifs via des canaux, ...)
  • les compositions (donc les propriétés physico-chimiques) très différentes des membranes propres à chaque compartiment sub-cellulaire
  • l'épissage alternatif et donc les différences de taux des différents transcrits d'un même gène (rôle des facteurs de transcription)
  • le taux de transcrits qui sont réellement traduits (phénomène d'interférence ARN, par exemple)
  • la modulation de l'activité des enzymes (à régulation allostérique ou sujettes à différents types d'inhibition)
  • les différents génomes (nucléaire, mitochondrial, chloroplastique) qui codent pour des protéines adressées à différents compartiments sub-cellulaires
  • la très large gamme de temps de demi-vie des macromolécules biologiques
  • les (dizaines de ?) milliers de réactions dans une cellule Eucaryote
  • ... (la liste est très longue)

On peut se demander s'il sera possible de modéliser l'ensemble de tous les processus cellulaires, a fortiori dans le cas de cellules trés spécialisées d'Eucaryotes.

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5. Les modèles métaboliques sous contraintes

Le formalisme des vitesses des réactions enzymatiques peut-être une expression complexe de [la concentration des métabolites x constantes de vitesse des réactions].

De plus ces vitesses sont en permanence modulées par les processus de régulation :

  • régulation de la transcription des gènes
  • régulation de la traduction en enzymes
  • régulation de la synthèse des substrats, des produits, des molécules effectrices de l'activité de ces enzymes (le métabolisme)
  • régulation du transport des métabolites
  • ...

Décrire par le détail les équations qui traduiraient ces deux parties (cinétique enzymatique et processus de régulation) est une gageure tant sur le plan mathématique qu'en ce qui concerne le nombre de données requises. Et ce d'autant que l'on a aucune certitude de disposer de manière exhaustive de ces données.

Pour s'en convaincre, il suffit de regarder ce que l'on connait du métabolisme de base. On mesure la complexité inouie des modèles qu'il faudrait développer.

En pratique, ce jour, on restreint donc la modélisation cinétique des réseaux métaboliques d'une "cellule entière" des modèles plus "petits" qui incluent des centaines (voire des miliers) de réactions (d'enzymes) et de métabolites, associés autant de gènes.

Ainsi, les modèle du métabolisme sous contraintes contournent ces limitations en focalisant sur la moyenne des vitesses des réactions qu'atteint la croissance cellulaire dans un environnement stable - stationnaire ou évoluant trés lentement.

La notion d'état stationnaire est capitale.

Cette approximation est justifiée en regard de la différence d'échelles de temps trés différentes :

  • macroscopiquement, le temps nécessaire l'ensemble du métabolisme d'une cellule pour se stabiliser est supérieur la minute et comparable au temps nécessaire pour l'internalisation de support nutritif et d'excrétion de déchets.
  • en revanche, microscopiquement, le temps nécessaire une réaction enzymatique pour atteindre l'état stationnaire est très largement inférieur la minute.
  • de plus, puisque les changements environnementaux et les variations de concentrations en enzymes s'échelonnent eux-aussi sur des échelles de temps longues, il n'est pas nécessaire de prendre en compte les aspects liés aux processus de régulation dans ce type de modèle.

En d'autres termes : la vitesse de renouvellement des métabolites étant trés élevée chez les bactéries l'échelle de temps considéré (la minute), on peut considérer que leur concentration a atteint l'état stationnaire et qu'elle est alors constante tant qu'il n'y a pas de variation de l'environnement.

En conséquence, pour simplifier les modèles, on s'appuie sur le fait que l'état métabolique d'une cellule et sa variation dans le temps peuvent être décrits par la concentration des métabolites et la vitesse des réactions.

Ces quantités sont liées par la loi de la conservation de la matière : la vitesse de production nette d'un métabolite est égale la somme des vitesses des réactions qui le consomment et des vitesses des réactions qui le produisent, pondérées par les coefficients stoechiomètriques associés chaque réaction.

Cette loi contraint la consommation et la production être équilibrée ( le terme anglo-saxon est "balanced") : c'est ce que l'on appelle l'hypothèse du quasi-équilibre.

La contrainte sur les vitesses de réaction s'apelle la contrainte d'équilibre des masses ou contrainte stoechiométrique des masses ("mass balance constraint").

Ainsi, pour chaque métabolite d'un tel système "équilibré", on peut écrire une expression mathématique simple de la contrainte d'équilibre des masses linéaires qui met en jeu la vitesse des réactions :

A l'état stationnaire : ∑ Si . νi = 0

o :

  • Si est le coefficient stoechiométrique du métabolite i impliqué dans la réaction i
  • νi est la vitesse de cette réaction i
  • νi ≥ 0, ∀ i
  • Pour peu que l'on ait des valeurs précises des vitesses des réactions, on peut imposer des bornes de valeurs ces vitesses : αi ≤ νi ≤ βi

En même temps, la vitesse de croissance de la biomasse de la cellule Vbiomasse doit être maximisée : z = cT

Remarques :

  • le formalisme mathématique global des modèles est beaucoup plus complexe.
  • voir la liste des composants de la biomasse pour le modèle de reconstruction C4GEM des plantes à métabolisme en C4

Figure ci-dessous : schéma qui décrit un modèle, la matrice de coefficients stoechiomètriques et des prédictions dans le cas de 2 types de contrainte :

  • l'une appliquée à une modification intra-cellulaire via la délétion de gènes qui se traduit par l'absence d'enzymes catalysant des réactions du système
  • l'autre, extra-cellulaire, via l'absence d'un nutriement externe

Les vitesses de réactions sont représentées par de simples nombres : les flux de réactions qui sont normalisés par le poids des cellules.

L'unité des flux de réactions est donc : mmol.h-1.g-1 de matière sèche (en anglais : "mmol.h-1.g-1 dry weight" ou "mmol.h-1.g-1 DW").

metabolomique genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE iterative procedure biochimej

Source : Génoscope

Besoins cellulaires en ATP hors croissance ("Non-growth associated ATP maintenance requirement / NGAM")

C'est la quantité d'ATP dont a besoin toute cellule même quand il n'y a pas de croissance. Il s'agit donc de l'énergie consommée pour tous processus autres que la la formation de nouveau matériel cellulaire.

Dans l'étude ci-contre, les auteurs ont maximisé le renouvellement en ATP sous une contrainte d'absorption du glucose de 1 mmol.h-1.g-1de matière sèche.

Ainsi la quantité d'ATP nécessaire a été évaluée à : Qmax = 21.5 mol ATP.mol-1 glucose.

Sur la base de cette valeur et du point d'intersection avec l'axe des ordonnées (0.105 mmol glucose.h-1.g-1de matière sèche), les auteurs ont calculé un NGAM # 2.26 mmol ATP.h-1.g-1de matière sèche.

Non-growth associated ATP maintenance requirement requis en absence de croissance genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE contrainte constraint

Source : Chung et al. (2010)

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6. Vérification de la robustesse des modèles et amélioration

a. Les difficultés pour modéliser pleinement le métabolisme (liste non-exhaustive) :

  1. famille multigénique codant une même enzyme
  2. différents transcrits à partir d'un même gène / des adressages (peptides signaux) compartimentaux distincts / d'éventuelles modifications post traductionnelles
  3. plusieurs isoformes d'une même enzyme
  4. structure IV d'une enzyme (cas de plusieurs sous-unités différentes)
  5. les complexes multienzymatiques
  6. les concentrations réelles d'enzymes et/ou de métabolites (Bennett et al., 2009)
  7. les concentrations limitantes d'enzymes et/ou de métabolites
  8. les réactions réversibles (au voisinage de l'équilibre) et les réactions irréversibles (ΔG' << 0)
  9. la trés large gamme des concentrations intracellulaires qui s'échelonnent du pM au mM
  10. la compartimentation cellulaire qui peut séparer un substrat de l'enzyme qui agit dessus : faute de transporteur, la réction ne peut avoir lieu
  11. la modulation de l'activité enzymatique : fixation coopérative, régulation allostérique - fixation d'effecteurs (inhibiteurs ou activateurs - effets homotropes ou hétérotropes)
  12. les paramètres physico-chimiques : température, pH, force ionique, co-facteurs ...
  13. la spécificité large de classes de substrats pour certaines enzymes (exemple : les alcool déshydrogénases - EC 1.1.1.1) ou les enzymes qui agissent sur des acides gras de longueur ou de degré de saturation variables
  14. les enzymes qui agissent sur différents substrats avec des KM trés différents
  15. la connectivité des métabolites qui reflète leur fréquence d'utilisation dans diverses réactions (et donc leur interaction avec d'autres métabolites)
  16. métabolites non encore connus : exemple de la découverte tardive du fructose 2,6-bisphosphate, modulateur clé de la régulation de la glycolyse et de la néoglucogénèse
  17. ...

b. Le cas des réactions et des enzymes manquantes (connues et/ou non connues)

  • L'équilibre des masses peut être vérifié sur la base des compositions chimiques des métabolites (base de données spécifiques telle que Pubchem).
  • Il ne peut y avoir de métabolites associé à un coefficient stoechiomètrique nul ou négatif. L'exemple ci-dessous est incohérent ("inconsistent") puisque le coefficient associé à C doit être nul.

k1
A    ----------->   B
k2
   A   ----------->    B + C

  • Les métabolites jamais consommés ou produits ("dead-ends metabolites") sont des révélateurs trés utiles pour mettre en évidence des réactions (métabolites et/ou enzymes) qui manquent : une réaction qui manquerait dans une voie linéaire annulerait le flux. Or, pour que le modèle soit fonctionnel, il ne doit pas y avoir de flux non-nul prédit.

Gevorgyan et al. (2008) "Detection of stoichiometric inconsistencies in biomolecular models" Bioinformatics 24, 2245 - 2251

c. Schéma general du processus itératif de vérification et d'amélioration d'un modèle de reconstruction.

Un modèle initial est reconstruit à partir d'annotations de génomes, de données biochimiques et physiologiques, disséminées dans diverses bases de données (généralistes ou spécialisées).

Le modèle qui en résulte est alors corrigé et affiné de manière itérative :

  • sur la base de critères de consistance interne
  • en comparant les prédictions du modèle et les données expérimentales

La reconstruction que la vérification d'un modèle métabolique est donc un travail colossal en terme de données à compulser, trier ("data mining"), voire à corriger ("curation"). C'est un travail extrêmement long.

Source : Durot et al. (2009)

metabolomique demarche iterative genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE biochimej

d. Exemple d'un cycle de reconstruction itérative d'un modèle

Figure ci-dessous : détail d'un cycle de reconstruction d'un sous-ensemble de réactions à partir d'un réseau (ensemble coordonnée de réactions) existant.

1. Un modèle est construit qui tient compte de l'entrée et de la sortie de nutriements ("Exc i") avec une synthèse globale de matériel biologique ("Biomass"). On constate qu'aucune réaction n'est privilégiée.

2. Une matrice de coefficients stoechiomètriques (voir ci-dessus) est construite.

3. Les vitesses de chacune des réactions de ce système sont calculées à partir de cette matrice et des équations de vitesse de chaque réaction.

4. Ce modèle est appliqué au système biologique soumis à une condition expérimentale particulière (ici, inactivation d'une réaction - R7 - et absence d'un nutriement - F).

5. Les points de convergence et les différences entre le modèle théorique et celui qui correspond à la réalité biologique permettent de re-construire le modèle théorique selon le même principe afin de le re-confronter à celui qui décrit la condition expérimentale.

Source : Durot et al. (2009)

Voir en particulier :"Table 4 : Existing genome-scale metabolic models for bacterial organisms"

Detail procedure genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE

Ce processus itératif permet d'améliorer le modèle théorique afin qu'il traduise le mieux possible la réalité biologique et puisse être extrapolé à d'autres conditions.

e. Exemples d'outils bioinformatiques pour la vérification de modèles :

  • Barua et al. (2010) "An Automated Phenotype-Driven Approach (GeneForce) for Refining Metabolic and Regulatory Models" PLoS Comput. Biol. 6, e1000970
  • Jenkinson et al. (2010) "Thermodynamically consistent Bayesian analysis of closed biochemical reaction systems" BMC Bioinformatics 11, 547

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7. Les méthodes d'analyse des modèles

a. Descriptions de quelques théories et concepts

Article : Bennett et al. (2009) "Absolute Metabolite Concentrations and Implied Enzyme Active Site Occupancy in Escherichia coli" Nat. Chem. Biol. 8, 593 - 599

  • Metabolomic Flux Analysis (MFA)
  • Thermodynamics-Based Metabolomic Flux Analysis (TMFA)
  • Network-embedded thermodynamic analysis (NET)

Ces théories permettent d'établir un lien entre la concentration des métabolites et la direction du flux métabolique.

En effet, le sens de n'importe quelle réaction du métabolisme est dictée par la variation d'énergie libre de Gibbs (ΔG'réaction) qui lui est associée.

Or celle-ci dépend exclusivement des concentrations intracellulaires (physiologiques / [X]φ) des métabolites impliqués dans cette réaction. Les concentrations [X]éq sont celles qui décrivent le système quand l'équilibre est atteint dans les conditions standards.

Pour une réaction :         A + B <===> C + D
                                           [C]éq  . [D]éq                                 [C]φ  . [D]φ
ΔG'réaction   =   - RT Ln  ( ---------------------- )   +   RT Ln  ( -------------------- )
                                          [A]éq  . [B]éq                                 [A]φ  . [B]φ

L'une des techniques les plus performantes pour mesurer les concentrations d'un trés grand nombre de métabolites est la spectromètrie de masse (par exemple : "liquid chromatography-tandem mass spectrometry"), combinée au marquage par des radioéléments.

Source : Kell, DB (2004)

liquid chromatography tandem mass spectrometry masse molaire moyenne metabolite genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE

Article : Henry et al. (2007) "Thermodynamics-based metabolic flux analysis" Biophys. J. 92, 1792 - 1805

TMFA, rapports des concentrations ATP/ADP, rapports des concentrations NAD(P)/NAD(P)H, rapports des concentrations H+extracellulaire/H+intracellulaire.

b. L'analyse de la balance des flux ("Flux balance analysis - FBA")

Cette approche ne nécessite pas de connaitre la concentration des métabolites ni le détail des cinétiques enzymatiques du système.

L'hypothèse est que le système étudié est homéostatique. Le question à résoudre dés lors s'énonce de la manière suivante : compte-tenu de nutriements disponibles, quel ensemble de flux métaboliques maximise la vitesse de croissance de l'organisme tout en préservant la concentration intracellulaire des métabolites ?

c. Autres méthodes d'analyse

  • Price et al. (2003) : "Singular Value Decomposition (SVD) of extreme pathways"
  • "Elementary mode of extreme pathways" (proche de la méthode SVD) : c'est le plus petit sous-réseau métabolique d'un réseau donné qui de fonctionner à l'état stationnaire.
  • Larhlimi & Bockmayr (2008) : "Minimal metabolic behaviors for the analysis of metabolic networks"
  • Lee et al. (2008) : "integrated dynamic Flux Balance Analysis" (idFBA)
  • Yizhak et al. (2010) : "Integrative omics-metabolic analysis method" (IOMA)

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8. Exemples d'études et d'applications

Figure ci-contre, la procédure suivie pour la reconstruction métabolique de Pichia pastoris.

Voir les données statistiques des éléments du modèle final.

Source : Chung et al. (2010)

Liens vers les bases de données mentionnées dans cette figure.

Pichia pastoris genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE

Autre exemple : étude du contrôle du métabolisme glucidique lié aux diabètes de type 2

Figure ci-contre : schéma synoptique de la méthode d'identification de métabolites rapporteurs et des motifs de séquences régulatrices associées.

Source : Zelezniak et al. (2010)

diabete type 2 genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE

Figure A : Système de score pour l'identification de métabolites rapporteurs, basé sur les scores des réactions enzymatiques associées.

Pour chaque enzyme, un score est aussi calculé sur la base de la "p-value" de la séquence nucléotidique du gène correspondant.

Dans le cas de réactions catalysées par un complexe enzymatique ou un ensemble d'isoformes d'une même enzyme, la valeur minimale de la "p-value" de ces enzymes est retenue.

  • chiffres en gras : "Z-score" pour chaque réaction
  • autres chiffres : "p-value"

Figure B : Identification des motif de fixation des facteurs de transcription. Pour un métabolite rapporteur, un ensemble de gènes homologues codant des enzymes qui sont sur- ou sous-exprimés est sélectionné.

Les régions promotrices et les motifs situés en amont des sites de démarrage de la transcription ("transcription start site - TSS") de chaque gène sélectionné sont annotés selon leur teneur en motifs de fixation des facteurs de transcription ("TF").

Figure ci-contre : signatures métabolique et régulatrice des diabètes de type 2.

Source : Zelezniak et al. (2010)

genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE diabete type 2

Les métabolites rapporteurs appartenant aux voies clés de la régulation des diabètes de type 2 sont écrits en gras.

  • flèches et encarts en gris : hypothèses ou résultats antérieurs à l'étude de Zelezniak et al.
  • lignes pleines : effets directs
  • lignes pointillées : effets indirects

Une sur-alimentation chronique et un manque d'activité physique augmentent l'entrée d'acides gras, ce qui induit la β-oxidation via l'activation des gènes médiée par le facteur activé de prolifération des peroxysomes (récepteur nucléaire - PPARα/δ - "peroxisome proliferator-activated receptor alpha and delta") sans qu'il y ait une augmentation coordonnée du flux du cycle des acides tricarboxyliques (TCA).

Une conséquence possible est l'accumulation dans les mitochondries de dérivés de métabolites (exemples : acylcarnitines ou molécules réactives dérivées de l'oxygène - "reactive oxygen species - ROS") issus d'une β-oxidation incomplète.

Ces stress pourrait induire une "surcharge mitochondriale" qui, de concert avec des molécules lipidiques de signalisation (exemple : le dyacylglycérol - DAG) enclencheraient une cascade impliquant des (Ser/Thr) protéines kinases, cascade qui serait initiée par une nouvelle protéine kinase nPKCs ("novel protein kinase Cs").

Il en résulte une phosphorylation des sites (Ser/Thr) du substrat 1 du récepteur de l'insuline (IRS-1) qui a pour conséquences :

  • l'inhibition de la phosphorylation des sites Tyr de IRS-1
  • l'activation de la phosphoinositol 3-kinase (PI 3-kinase)

Ces 2 évènements entravent la translocation du transporteur du glucose de type 4 (GLUT4) ce qui diminue le transport du glucose et donc la synthèse du glycogène.

Une augmentation de l'activité physique ou le jeûne activent la protéine PGC1α (co-activateur 1α du récepteur nucléaire PPARγ) et la protéine CREB ("cAMP response element binding protein"), un activateur puissant de PGC1.

Ces évènements atténuent le effets du stress lipidique en augmentant le flux du TCA et en couplant l'activité induite par la fixation du ligand sur PPARα/δ avec le remodelage médié par PGC1α des voies métaboliques situées en aval telles que la respiration et la β-oxidation.

Légende : CDP-choline, cytidine diphosphate choline; G1P, glucose 1-phosphate; G6P, glucose 6-phosphate; GSK3, glycogen synthase kinase-3; IRE1, inositol requiring kinase-1; LC-CoAs, long-chain acyl CoAs; PA, phosphatidate; PH, pleckstrin homology domain;PI, phospatidylinositol; PIP, phospatidylinositol 4-phospate; PIP2, phosphatidylinositol 4,5-bisphospate, PIP3, phospatidylinositol 3,4,5-trisphospate; PTB, phosphotyrosine binding domain; RXR, retinoid X receptor; SH2, src homology domain; TF, transcription factor; CPT1, carnitine palmitoyltransferase-1; PTDETN, phosphatidylethanolamine.

Autre exemple : voir les applications en biotechnologies industrielles et médicales.

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9. La base de données de modèles biologiques "Biomodels" (EBI)

Aller à la base de données BioModels Database.

Cliquer sur le lien : "Gene Ontology classification". Choisir la partie verte "Response to stimulus".

Choisir le modèle "Wang2007 - ATP induced intracellular Calcium Oscillation" : BIOMD0000000145

Figure ci-contre : modèle proposé par Wang et al. (2007) - "A quantitative kinetic model for ATP-induced intracellular Ca2+ oscillations" J. Theor. Biol. 245, 510 - 519.

Variables du modèle :

  • [Gα-GTP] : concentration du complexe entre le GTP et la sous-unité Gα activée de la protéine G
  • [APLC] : concentration de la forme active de la PLC
  • [IP3] : concentration de l'IP3
  • [Ca2+]cyt : concentration du calcium dans le cytoplasme
  • [Ca2+]RE : concentration du calcium libre dans le RE

Modele oscillation calcique genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE BioModels database

  • d[S]/dt est le vecteur des vitesses
  • N est la matrice des coefficients stoechiomètriques
  • v est le vecteur des lois de réactions

Source : Wang et al. (2007)

stoechiometric matrix modele oscillation calcique genome-scale metabolic network reconstruction modelling GENRE

a. Quel type de signal ce modèle essaye-t-il de modéliser ?

b. Faire le lien entre les informations contenues dans l'onglet "Math" et le modèle décrit ci-dessus.

c. Dans le menu déroulant "Actions" :

  • Choisir : "View Bitmap Recation Graph". Faire le lien entre le modèle obtenu et les informations contenues dans l'onglet"Math".
  • Choisir : "View Dynamic Reaction Graph" (Applet java) pour visualiser le réseau d'interactions. Les différentes interactions sont obtenues en cliquant sur les composés du modèle.
  • Choisir : "BioModels Online Simulation" pour visualiser la simulation de la cinétique d'évolution du modèle.

d. Quelle information obtient-on dans l'onglet «Physical entities» ?

e. Aller à : "Models of the month".

March 2010, model of the month - C. Hoyer : Borisov et al. (2009) "Systems-level interactions between insulin-EGF networks amplify mitogenic signaling" Mol Syst Biol. 5, 256

Quelques mots clés : "Epidermal growth factor / Insulin / EGF receptors (EGFR) / Insulin receptor / receptor tyrosine kinases"

Cet article illustre le modèle : BIOMD0000000223 - Borisov 2009 EGF Insulin Crosstalk

 

10. Liens Internet et références bibliographiques
  • GOLD : "Genomes OnLine Database"
  • metaTIGER : base de données de voies métaboliques et d'informations phylogénomiques pour un trés grand nombre d'eucaryotes.
  • KEGG pathways : base de données de voies métaboliques
  • BioCyc : Bases de données voies métaboliques (EcoCyc, MetaCyc, AraCyc, YeastCyc)
  • MetaRoute : "web interface for interactive navigation through genome-scale networks and local network visualization"
  • BioModels Database : "A Database of Annotated Published Models"
  • BiGG : "Repository of reconstructed genome-scale metabolic models"
  • The Human metabolome project

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