Les ARN et le monde à ARN ("RNA world") - les ribozymes
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1. Le monde à ARN

2. Le monde prébiotique - l'expérience de Stanley Miller

3. Les ribonucléotides et l'acide ribonucléique (ARN)

a. Structure générale
b. Les bases modifiées des ARN de transfert (ARNt)

4. Les différents types d'ARN et leurs rôles

5. L'ARN est un catalyseur

6. Les ribozymes

a. Familles de ribozymes auto-clivants

 

b. Mécanisme catalytique des ribozymes auto-clivants

7. Les introns du groupe II (ribozyme)

a. Hypothèse d'un mécanisme évolutif commun au spliceosome et aux introns du groupe II
b. Rôle du lariat dans l'épissage des introns de groupe II

8. Les riboswitches

a. les classes de riboswitches
b. Mécanisme

9. Liens Internet et références bibliographiques

 

1. Le monde à ARN

Le terme "RNA world" - "monde à ARN" a été employé pour la première fois en 1986 par Walter Gilbert (texte ci-contre) qui s'intéressait principalement à la manière dont l'ARN catalytique aurait pu donner naissance à la structure exon-intron des gènes.

L'idée avait été préalablement formulée par Alexander Rich en 1962 et Carl Woese en 1967.

Walter Gilbert a reçu le Prix Nobel de chimie en 1980 avec Fréderick Sanger "for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids."

Source du texte ci-contre : Gilbert W. (1986)

 

Monde ARN RNA world protein DNA ribozyme riboswitche endosymbiose prebiotique LUCA Gilbert biochimej

Le monde primitif à ARN est une époque hypothétique où l'ARN servait à la fois d'information et de fonction, à la fois de génotype et de phénotype. Il s'agirait d' une période dans l'histoire primitive de la Terre (il y a environ 4 milliards d'années) au cours de laquelle la substance vivante primaire était l'ARN (ou une molécule chimiquement similaire).

Ci-dessous, modèle "monde à ARN" de l'apparition successive d'ARN, de protéines et d'ADN au cours de l'évolution de la vie sur Terre.

Monde ARN RNA world protein DNA ribozyme endosymbiose prebiotique LUCA Gilbert biochimej

Source : Cech T.R. (2012)

De nombreux mélanges isolés de molécules organiques complexes (contenant entre autres des acides aminés et des peptides courts) n'ont pas réussi à s'auto-répliquer et sont donc morts (flèches vers l'extinction - les points).

La voie qui a conduit à l'ARN auto-répliquant a été préservée chez ses descendants modernes. Les flèches à gauche de l'ARN auto-répliquant représentent les systèmes hypothétiques capables de se répliquer qui ont précédé l'ARN.

Les protéines assez grosses pour se replier automatiquement et posséder une fonction ne sont apparues que lorsque l'ARN était disponible pour catalyser la formation de la liaison peptidique (polymérisation d'acides aminés).

LUCA ("Last Universal Common Ancestor" - dernier ancêtre commun universel) possédait déjà un génome à ADN et effectuait une biocatalyse à l'aide d'enzymes protéiques ainsi que d'enzymes ribonucléoprotéiques (comme le ribosome) et de ribozymes.

Le monde à ARN est une hypothèse pour laquelle on accumule de plus en plus de preuves mais qui demeure malgré tout une hypothèse.

Les ribozymes

  • Les ribozymes participent à la synthèse de protéines via l'activité des ribosomes : la grande sous-unité ribosomale contient des ARN qui catalysent la réaction de transfert peptidyle.
  • Les ribozymes participent à l'épissage des ARN et d'autres processus de maturation.
  • La sous-unité ARN catalytique du complexe ribonucléoprotéique RNase P modifie les extrémités 5' des ARN de transfert.
  • Certains ribozymes nucléolytiques sont impliqués dans la réplication en cercle roulant des génomes d'ARN, dans la modification co-transcriptionnelle des rétrotransposons et dans la régulation de la transcription des gènes chez les bactéries.

D'autres rôles biologiques des ribozymes restent à découvrir et/ou à étudier.

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2. Le monde prébiotique - l'expérience de Stanley Miller

En 1952, Stanley Miller (Université de Chicago, Illinois) a effectué une des expériences les plus célèbres de la science moderne. Des décharges électriques (simulant la foudre) ont été envoyées dans un ballon rempli d'un mélange de gaz (vapeur d'eau, hydrogène, méthane et ammoniac) censé ressembler à l'atmosphère primitive de la Terre. Au bout d'une semaine, ce traitement avait converti une partie substantielle des gaz, non pas en un mélange aléatoire de molécules organiques, mais en un nombre restreint de composés importants sur le plan biochimique : en particulier les acides aminés (nécessaires à la synthèse de protéines), des hydroxyacides et l'urée.

Ces éléments ont pu constituer le mélange à l'origine des biomolécules, qu'on appelle la soupe primordiale ou soupe primitive ou soupe prébiotique.

  • Ces résultats ont apporté les premiers éléments de modèles décrivant comment la vie a pu débuter sur terre. Leur publication a ainsi ouvert l'ère moderne de l'étude de l'origine de la vie.
  • Dernière évaluation : microorganismes fossilisés potentiels de 4,28 milliards d'années (Dodd et al., 2017) isolés dans des roches sédimentaires de la ceinture de Nuvvuagittuq (Québec, Canada).

L'article de Miller a été publié quelques semaines seulement après l'article de J. Watson et F. Crick sur le modèle d'ADN à double hélice. Le lien entre les deux champs naissants a été établi après qu'il fût démontré que l'adénine (base nucléique de l'ADN et de l'ARN) peut être synthétisée par oligomérisation du cyanure d'hydrogène. On peut y voir les prémices des propositions d'un monde à ARN (C. Woese, L. Orgel, F. Crick, W. Gilbert).

L'hypothèse du monde à ARN sous-tend que les liaisons établies entre les nucléotides libres au sein de la soupe prébiotique auraient été fréquemment rompues du fait de leur faible niveau d'énergie. Certains enchaînements de paires de bases avec des propriétés catalytiques modifiant le niveau énergétique de la chaîne créée, seraient restés formés plus longtemps. Au fur et à mesure que ces chaîne s'allongeaient, elles intégraient davantage de nucléotides et plus rapidement : la formation de ces chaînes devint ainsi plus rapide que leur dissociation.

Le ribose

L'étude des réactions dans des conditions imitant les cycles [pluie / évaporation] sur la terre primitive ont permis d'identifier 3 candidats potentiels pour les bases du proto-ARN : l'acide barbiturique, la mélamine et la 2,4,6-triaminopyrimidine. En effet, les réactions de ces molécules avec le ribose produisent des nucléosides.

Le mécanisme le mieux étudié pour la synthèse prébiotique du ribose est la réaction de formose (A. Boutlerov, 1861; R. Breslow, 1959) qui consiste en une série de polymérisations du formaldéhyde (H2C=O) commençant par une conversion très lente de 2 molécules de formaldéhyde en glycolaldéhyde, suivies d'une fixation rapide de HCHO qui forme des glucides intermédiaires vers des mélanges plus complexes.

Cette réaction n'explique cependant pas la synthèse primitive de la molécule ARN.

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Modèle de l'évolution chimique de la vie

La figure ci-dessous décrit l'évolution chimique sous forme d'ensembles de réactions en 4 étapes : (1) condensation de composés inorganiques en précurseurs organiques réactifs; (2) conversion des précurseurs en blocs de construction biologiques; (3) formation de polymères par déshydratation / condensation de leurs monomères respectifs; (4) émergence et développement de fonctions biologiques selon une évolution Darwinienne aboutissant à l'origine de la vie.

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Source : Kitadai & Maruyama (2018)

Phase gazeuse réductrice (flèches brunes); pH alcalins (flèches rouges); températures de congélation (flèches roses); eau douce (flèches bleues); cycles [sec / sec-humide] (flèches oranges; couplage avec des réactions à haute énergie (flèches grises); cycles [chauffage - refroidissement dans l'eau] (flèches vertes).

  • Les réactions en phase gazeuse génèrent divers composés simples et très polyvalents, notamment : HCN (molécule 14), H2C=O (31), cyanogène (8), cyanamide (18), cyanoacétylène (24), acroléine (58) et phénylacétylène (61) par l'action de l'éclairage et du rayonnement (UV, rayons X, ...)
  • Un pH alcalin (8 - 10) favorise la conversion de HCN en formamidine (4), diaminomaléonitrile (5), formamide (9), aminomalononitrile (10), urée (13) et guanidine (20).
  • La production de formose de ribose à partir de H2CO (31) nécessite un pH alcalin (10 - 11) avec le calcium comme catalyseur au stade initial (glycolaldéhyde 32).
  • Précurseurs organiques clés : HCN (14), cyanogène (8), formamide (9), cyanoacétaldéhyde (21) et cyanoacétylène (24).
  • Cations métalliques : Cu2+, Fe2+, Mg2+, Pb2+ et Zn2+. Les métaux dissous entraînent également une précipitation du phosphate.
  • Synthèse de ribonucléotides pyrimidines à partir de cyanamide (18), de cyanoacétylène (24), de glycéraldéhyde (27) et de glycolaldéhyde (32).

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3. Les ribonucléotides et l'acide ribonucléique (ARN)

a. Structure générale

L'ARN est un polymère linéaire composé de 4 nucléotides : l'adénosine monophosphate (AMP), l'uridine monophosphate (UMP), la guanosine monophosphate (GMP) et la cytidine monophosphate (CMP). Chaque nucléotide est constitué d'une base aromatique plane attachée à un ribose (cycle furanose) et d'un groupe 5'-phosphate.

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La ribothymidine est trouvée essentiellement dans la boucle T des ARN de transfert (ARNt) à laquelle elle donne son nom. Lors de la transcription, une uridine est incorporée en position 54 dans le précurseur de l'ARNt puis cette uridine est modifiée par l'ARNt (uracile(54)-C(5))-méthyltransférase (EC 2.1.1.35) en ribothymidine. Elle joue un role important dans la stabilisation de la structure 3D des ARNt.

Conséquence du groupe hydroxyle 2'OH du ribose

Ce groupe induit de profondes différences entre l'ADN et l'ARN. Principalement parce qu'il rend la molécule d'ARN moins stable chimiquement que la molécule ADN en facilitant les réactions d'auto-clivage :

  • La molécule ADN (le génome) est donc mieux adaptée à la conservation de génération en génération de l'information génétique.
  • Le caractère transitoire de la molécule d'ARN se prête davantage à un rôle d'adaptateur dynamique aux changements d'état de la cellule.

La chimie prébiotique suppose que l'équilibre entre le clivage et la ligation des ARN a été déterminant :

  • dans l'assemblage spontané des premiers ARN en absence de modèle
  • dans l'apparition de l'évolution Darwinienne basée sur la compétition entre variants de séquence pour les ressources chimiques

Le groupe 2'-OH est un donneur et un accepteur de liaison hydrogène : il stabilise de nombreux types de paires de bases [non Watson-Crick] (non canoniques) que l'on ne trouve pas dans l'ADN et il facilite ainsi le compactage des hélices d'ARN. L'évolution s'est appuyée sur les propriétés d'auto-interaction de l'ARN pour générer un très grand nombre de structures très diverses capables d'établir des interactions spécifiques ARN - ARN, ARN - protéine, ARN - ADN, ARN - petite molécule ou ARN - ion.

Les différents types d'appariements des paires de bases

Les paires de bases de type Hoogsteen (Karst Hoogsteen) ont des caractéristiques structurales différentes des paires de bases de type Watson - Crick. L'angle entre les 2 liaisons glycosidiques (environ 80° dans la paire A - T) est plus grand et la distance C1' - C1' (environ 8,6 Å) est plus petite. Dans le cas des paires de bases de type Hoogsteen inversé, une base est tournée de 180° par rapport à l'autre.

Une paire de bases de type wobble est un appariement entre 2 nucléotides dans les molécules d'ARN qui ne suit pas les règles des paires de bases de type Watson - Crick. Les 4 principales paires de bases de ce type sont : G - U, hypoxanthine - U, hypoxanthine - A et hypoxanthine - C.

Quelques exemples de structures secondaires et tertiaires de l'ARN

Monde ARN RNA world Sanger Gilbert base phosphate phosphodiester nucleotide nucleoside ribonucleotide biochimej

Source : Blythe et al. (2016)

  • En haut, petite région située à l'extrémité 5' du long ARN non codant ("long ncRNA" - voir ci-dessous) de B2-SINE.
  • "Triple helix" : une région double brin de l'élément d'expression et de rétention nucléaire ("Expression and Nuclear retention Element" - ENE) séquestre la queue poly-A de l'ARN (en magenta) par des interactions de type Watson - Crick et de type Hoogsteen qui aboutissent à une triple hélice stabilisante (PDB 3P22).
  • "Kissing loop" : boucle entre le substrat [tige-boucle] et le domaine catalytique [tige-boucle] par le ribozyme Neurospora Varkud satellite (voir ci-dessous - PDB 2MI0). Les 3 paires de bases de type Watson - Crick responsables de l'interaction entre les deux boucles sont en pointillés.
  • "Pseudoknot" : interactions réciproques entre 2 [tiges-boucles] où la boucle de chaque [tiges-boucles] forme la tige de l'autre (PDB 1A60 - virus de la mosaique jaune du navet). Les paires de bases de type wobble et de type non Watson - Crick sont représentées par des cercles vides et pleins, respectivement.

La liaison phosphodiester

Les chaînes d'ARN sont formées par la formation de liaisons phosphodiester entre les résidus de sucre successifs : les extrémités dites 5' et 3' de la chaîne sont libres : les chaînes d'ARN sont donc asymétriques (par exemple, 5'-ACGU-3 et 3'-ACGU-5' sont des molécules différentes).

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L'extrémité 5' est considérée comme le début de la chaîne car c'est à cet extrémité que débute la synthèse de la chaîne chez les organismes.

Voir un cours sur le métabolisme des bases puriques, des bases pyrimidiques et des nucléotides.

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b. Les bases modifiées des ARN de transfert (ARNt)

Les ARNt sont des petits ARN de 75 à 95 nucléotides qui jouent un rôle capital dans la traduction.

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La pseudouridine (Ψ) résulte d'une modification post-transcriptionnelle de l'uridine (isomérisation par rotation de 180° du cycle pyrimidine). C'est la modification la plus fréquente des bases des ARN et elle contribue à la stabilisation de la structure 3D des ARNt. La boucle TΨC comporte une pseudouridine.

La 5,6-dihydrouridine (boucle D) est non-plane. Elle perturbe les interactions d'empilement des bases dans les hélices et déstabilise la structure des ARN. Cette particularité est utilisée par certains organismes qui se développent à des températures trés basses et qui ont des ARNt riches en 5,6-dihydrouridine. Leurs ARNt restent ainsi localement flexibles à ces températures.

L'inosine contient une purine particulière : l'hypoxanthine. L'inosine peut former des appariements de type wobble ("appariement bancal") I-U, I-A et I-C. Ainsi, l'inosine est fréquemment en première position de l'anti-codon des ARNt, permettant au même ARNt de s'apparier à plusieurs codons synonymes. L'inosine résulte de la désamination de l'adénine par l'adénine désaminase (EC 3.5.4.2).

On trouve également : la 1-méthyladénosine, la 1-méthylguanosine, la 5-méthylcytidine, ... (oir la base de données : The genomic tRNA database).

L'immunoprécipitation des ARN méthylés, suivie d'une technique de séquençage à haut débit ("Methylated RNA immunoprecipitation followed by sequencing" - MeRIP-Seq) permet d'obtenir le profil de la N6-méthyl-adénosine (m6A) à l'échelle du transcriptome.

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4. Les différents types d'ARN et leurs rôles

La figure ci-dessous illustre les rôles clés des ARN et des ribonucléotides dans les processus cellulaires. La voie de biosynthèse des ribonucléotides est très conservée.

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Source : Vazquez-Salazar & Lazcano (2018)

Les molécules d'ARN peuvent être divisées en deux types : les ARN codant ("coding" - ARNc) et non codant ("non coding" - ARNnc). Comme les riboswitches, les longs ARNnc ("long ncRNA") et les petits ARNnc ("small ncRNA") jouent un rôle clé dans la régulation de la transcription des gènes.

Les ribonucléotides sont réduits en désoxyribonucléotides par la ribonucléotide réductase (RNR) et certains de leurs dérivés, comme les coenzymes, participent à la catalyse et à l'activation ou l'inhibition des processus cellulaires dans des conditions de stress.

Les différents types d'ARN

(1) L'ADN est transcrit par 3 ARN polymérases différentes en transcrits primaires ou précurseurs (Pre-RNA) des ARN ribosomiques (ARN polymérase I), des ARN messagers (ARN polymérase II) et des petits et grands ARN non codants (ARN polymérase III).

(2) Les ARN ribosomiques (ARNr - composants du ribosome) sont impliqués dans la traduction des ARN messagers. Le transcrit primaire de l'ARNr code pour 3 des quatre ARNr (5.8S, 18S et 28S). Il est synthétisé par l'ARN polymérase I et hydrolysé dans le nucléole à l'aide des petites RNP nucléolaires (snoRNPs / "small nucleolar RNA" - snoRNA).

L'ARNr (5S) est synthétisé par l'ARN polymérase III.

Monde ARN RNA world protein DNA ribozyme riboswitche endosymbiose prebiotique LUCA Gilbert biochimej

Source : Lieberman J. (2018)

Les petits ARN non codants (snRNA) synthétisés par l'ARN polymérase III incluent :

  • les snARN qui épissent les pré-ARN messagers au sein d'un complexe volumineux appelé le spliceosome (3)
  • les petits ARN nucléolaires ("snoRNA") qui participent à la maturation des ARNr (4)
  • les ARN de transfert ("tRNA") qui chargent les acides aminés sur la chaîne polypeptidique en cours de biosynthèse dans le ribosome (5)
  • les pré-microARN qui sont maturés en microARN (miRNA) dans le noyau. Les miRNA régulent le taux de la traduction en dégradant spécifiquement les ARN messagers ou en bloquant l'initiation de la traduction dans le cytosol : c'est l'interférence ARN.

Légende : 5' ETS et 3' ETS ("External Transcribed Spacer"). 5' ETS est un site d'hybridation des sno-ribonucléoprotéines U3. ITS ("Internal Transcribed Spacer") : ARN non fonctionnel entre les ARN ribosomiques structuraux. Gppp : guanosine triphosphate; UTR : "untranslated region" - région non traduite.

Les "enhancer RNA" (eRNA) représentent une classe d'ARN non-codant relativement courts (50 - 2000 nucléotides) transcrits (ARN polymérase II ) à partir des régions "enhancer" de l'ADN. Ils ont été détectés en 2010 (Kim et al., 2010) par les techniques RNAseq et ChIPseq. Les eRNA sont divisés en 2 classes (1D et 2D) qui diffèrent par leur taille, leur état de polyadénylation et la direction de leur transcription (dans un sens ou deux - transcription bidirectionnelle).

Voir un cours sur l'épigénétique.

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5. L'ARN est un catalyseur

Dans les cellules "modernes", les enzymes catalysent la quasi totalité des réactions. La raison principale de cette spécialisation est que l'évolution a rendu ces macromolécules spécifiques sur le plan structural des molécules sur lesquelles elles agissent : leur subsrat.

De manière similaire, les molécules d'ARN, du fait de la nature chimique des ribonucléotides qui les composent, peuvent établir de nombreuses liaisons (de divers types) entre ces ribonucléotides et, par voie de conséquence, adopter de nombreuses structures. Les molécules d'ARN ont donc, comme les enzymes, une aptitude à se replier dans l'espace de sorte que des groupements chimiques interagissent : c'est le propre de la catalyse.

Les coenzymes ribonucléotidiques de nombreuses protéines actuelles (tableau ci-dessous) pourraient être des fossiles moléculaires issus d'un métabolisme basé sur l'ARN.

Exemples de cofacteurs qui possèdent des parties structurales caractéristiques des nucléotides et des acides aminés Cofacteurs Description
Coenzyme A ADP-pantothénylcysteamine
Flavine-adénine dinucléotide Liée à des résidus Lys des protéines
Riboflavine-5'-phosphate Liée à des résidus Cys des protéines
S-adénosyl methionine S-adénosyl methionine
8-hydroxy-5-déazaflavine Liaison aux flavonoïdes
Adénosine 5'-phosphate
Guanosine 5'- phosphate

Le rôle de catalyseur de l'ARN est largement démontrée :

  • des catalyseurs naturels de type ribozyme ont été découverts dans les années 1980 : exemples, les introns auto-épissables et le catalyseur ribonucléase P impliquée dans la maturation des ARN de transfert
  • l'ARN ribosomal catalyse la formation de liaisons peptidiques dans le ribosome

Figure ci-dessous : organisation des domaines (numérotés de I à VI) d'un intron auto-catalytique de groupe II (ribozyme).

biochimej ARN RNA epissage alternatif intron group II ribozyme self splicing snRNA spliceosome exon lariat

Source : R. Batey (2014)

  • Une interaction à longue distance entre 3 paires de bases hautement conservées dans le domaine V et des nucléotides dans la région simple brin entre les domaines II et III font partie d'une structure appelée triplex catalytique qui est le cœur du site actif de l'ARN.
  • L'interaction π - π' entre une boucle du domaine II et une section du domaine VI adjacente à l'adénosine du site de branchement ferait basculer l'intron entre les 2 étapes d'épissage.
  • Le domaine IV porte souvent un gène ("Open Reading Frame" - ORF; pointillés) codant une protéine qui facilite la catalyse de l'épissage ou la mobilité de l'intron du groupe II. Il s'établit davantage d'appariements de paires de bases que ce qui est montré dans cette figure.

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Mécanisme d'auto-clivage de l'ARN

Cette réaction de clivage d'un site spécifique (sans l'aide de protéines chaperones ou d'enzymes) s'effectue en général par le transfert d'un groupement phosphoester interne via une réaction chimique impliquant la catalyse acide / base générale et un ion métallique.

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Source : Jimenez et al. (2015)

La catalyse acide-base générale implique une base générale qui déprotone le groupe 2'-hydroxyle du nucléophile, positionnée dans l'alignement du groupe 5'O partant.

La transestérification s'effectue via un intermédiaire état de transition phosphorane qui aboutit à un phosphate cyclique 2'-3' au niveau du nucléotide en amont et un oxyanion au niveau du nucléotide en aval. Le groupe partant est protoné par une base générale.

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6. Les ribozymes

Hormis le ribosome qui catalyse la formation de la liaison peptidique, tous les ribozymes découverts jusqu'à présent dans la nature catalysent l'hydrolyse ou la ligation d'une liaison phosphodiester ou catalysent les deux réactions.

Thomas Cech et Sidney Altman ont obtenu le prix Nobel de chimie en 1989 pour leur découverte des propriétés catalytiques de l'ARN.

Jennifer Doudna, Thomas Cech et leurs collaborateurs ont déterminé la structure du ribozyme intron de groupe I de Tetrahymena thermophila (Cate et al., 1996). J. Doudna est à l'origine de la découverte de certaines propriétés du système CRISPR-Cas9.

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Source des figures : Prix Nobel 1989

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a. Familles de ribozymes auto-clivants ("self-cleaving ribozymes")

Sur les 14 classes de ribozymes connues, 9 catalysent une réaction d'auto-clivage (commune également avec les ribonucléases) selon un mécanisme de transfert interne du phosphoester (mécanisme SN2).

Famille de ribozymes

Particularités

ribozymes de l'ARN satellite de Neurospora Varkud
L'ARN du satellite Varkud est un transcrit abondante de l'ADN mitochondrial de plusieurs isolats naturels de Neurospora

Ils appartiennent à la classe des ribozymes nucléolytiques (ribozymes hammerhead, hairpin et hepatitis delta virus) qui catalysent des réactions de clivage et de ligation réversibles sur un site spécifique par des réactions de trans-estérification impliquant les 2' et 5'-O et le 3'-P.
La reconnaissance du substrat dépend de la formation d'une interaction "kissing-loop" dépendante du Mg2+ entre la [tige-boucle I] du substrat et la [tige-boucle V] du domaine catalytique.

ribozymes en épingle à cheveux ("hairpin ribozyme") Ils font partie de l'ARN satellite de certains virus de plantes. Ils transforment les produits de la réplication du virus en molécules d'ARN satellite linéaire et circulaire (pas d'ion métallique pour la réaction).
ribozymes en tête de marteau ("hammerhead ribozyme") Découverts dans des viroïdes où ils interviennent dans la transcription en cercle roulant.

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R et Y : nucléotides purine et pyrimidine, respectivement - voir la légende dans la figure ci-contre.

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Source des figures : Weinberg et al. (2015)

Ribozymes "hepatitis delta virus" (HDV) ARN non codant du virus de l'hépatite delta, nécessaire à la réplication virale. Seul virus humain qui utilise l'activité du ribozyme pour infecter son hôte. Catalyse acide-base générale par la cytosine 75.
ribozymes de la glucosamine 6-phosphate synthase (glmS) Motif conservé situé dans la région 5'UTR du gène glmS codant la glutamine-fructose-6-phosphate amidotransférase chez de nombreuses bactéries à Gram+.
ribozymes twister (codes PDB : 4OJI, 5DUN)

Découverts en 2013 lors de recherches de motifs conservés par bioinformatique. Repliement caractérisé par la formation de 2 "pseudoknots" et l'empilement colinéaire de tiges hélicoïdales. Un pseudoknot est une structure secondaire d'acide nucléique formée par des interactions tertiaires à longue distance via des paires de bases de type Watson-Crick entre deux boucles.

ribozymes twister - sister

Ils ressemblent aux ribozymes "twister" (en particulier l'arrangement des tiges P1 à P5 et les similitudes des nucléotides de la boucle terminale P4).
Cependant, il n'y a pas de "pseudoknot" via l'appariement des bases de type Watson-Crick et la correspondance entre les nucléotides les plus conservés de chacun des deux types de ribozymes est faible.

ribozymes "pistol" (codes PDB : 5KTJ, 5K7C) Composés de 3 tiges, d'1 boucle en épingle à cheveux et d'1 bulle interne. La conformation pré-catalytique adopte une architecture tertiaire compacte stabilisée par un repliement "pseudoknot". Constante catalytique (2-aminopurine) de 0,08 min-1.
ribozymes "hatchet" Contiennent 13 résidus hautement conservés, séparés par des éléments reliant des segments de la tige. La scission de brins d'ARN dans ce type de ribozyme exige Mg2+ avec une constante catalytique de 4 min-1.
 

hammerhead pistol twister sister Varkud hatchet self cleaving scission monde ARN RNA world protein DNA ribozyme riboswitche endosymbiose prebiotique LUCA Gilbert biochimej

Source : Ren et al. (2017)

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Structure du ribozyme ARN satellite Varkud (mutant G638A) de Neurospora à une résolution de 3,1 Å

Code PDB : 4r4v

Ce ribozyme contient 7 segments hélicoïdaux séparés par des jonctions hélicoïdales à 3 voies.

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b. Mécanisme catalytique des ribozymes auto-clivants

Monde ARN RNA world protein DNA ribozyme riboswitche hammerhead pistol twister sister Varkud hatchet self cleaving scission lariat intron Gilbert base phosphate phosphodiester nucleotide nucleoside ribonucleotide biochimej

Source : Lee & Lee (2017)

  • L'atome d'oxygène 2' nucléophile d'un ribose (nucléotide en position +1) attaque l'atome de phosphore adjacent suivi d'une protonation et du départ de l'oxygène en 5' d'un ribose du nucléotide en position -1.
  • Le produit de la réaction en 5' est un groupe phosphate terminal 2',3'-cyclique et le produit de la réaction en 3' est un groupe hydroxyle 5'.
  • La réaction de ligation semble une simple inversion de la réaction de clivage qui génère la liaison phosphodiester 3'-5'.

Les mécanismes de clivage de l'ARN par les ribozymes pourraient être décrits par une ou par une combinaison de quatre actions moléculaires, qui contribuent à l'augmentation de la vitesse de catalyse :

  • l'orientation en ligne dans le site actif de l'oxygène nucléophile en 2', du phosphore électrophile et de l'oxygène partant en 5'
  • la neutralisation de la charge négative de l'oxygène-phosphate non liant
  • la déprotonation du groupe hydroxyle en 2'
  • la neutralisation et la stabilisation de l'oxygène partant en 5'

Ces caractéristiques structurales optimales pour la catalyse pourraient aussi expliquer en partie la réaction de transphosphorylation interne catalysée par une nucléase protéique : la ribonucléase A. En particulier, l'orientation en ligne (catalyse dite α) avec un angle de torsion de 180° est essentielle pour une réaction de type SN2.

Cependant, cette architecture n'est pas adoptée par une hélice d'ARN canonique : les ribozymes pourraient générer les interactions nécessaires à la stabilisation de cette conformation défavorable.

Caractéristiques de la catalyse par les ribozymes auto-clivants (voir figure ci-dessus)
Famille Alignement de la liaison 2'O -> P-5'O (catalyse α) Neutralisation de la charge négative de l'oxygène non liant (catalyse β) Déprotonation du nucléophile en 2' (catalyse γ) Protonation du groupe partant en 5' (catalyse δ) Vitesse de clivage (min-1) à pH neutre
Twister (O. sativa) 83° (4OJI) G45 G45 A7 2,45
Twister (env9) 83° (4QJH) A63 G62 --- ---
Twister (env22) 148° (4RGE) G48, Mg2+ G48 ? A6 ? 2,44 (à 20°C)
91° (5DUN) Mg2+- eau liée ? 1,41 (à 15°C)
Pistol 167° (5K7C) G40 G40 A32 (or G32) 2,72 (à 20°C)
126° (5KTJ) 0,88 (à 15°C)
HDV 140° (5DI2) Mg2+ Mg2+ C75 52
Hammerhead --- --- G12 G8, eau liée au métal 1,39
Hairpin --- G8 G8 A38 0,1 - 0,5
Neurospora Varkud --- G638 G638 A756 1
glmS --- GlcN6P G40 GlcN6P 1 - 3
Source : Lee & Lee (2017)

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7. Les introns du groupe II (ribozyme)

a. Hypothèse d'un mécanisme évolutif commun au spliceosome et aux introns du groupe II

Les introns du groupe II sont des introns auto-catalytiques donc des ribozymes. Ils contiennent une structure en épingle à cheveux appelée domaine V (figure ci-dessous).

Les introns des groupes I et III sont également des ribozymes auto-épissables.

Figure a : élimination des introns (en rouge) et rattachement des régions des exons adjacents (en vert). Les réactions de transfert de phosphoryle lors de l'épissage (dont la première est indiquée par une flèche orange) sont catalysées par deux ions métalliques divalents (M1 et M2) qui établissent des liaisons de coordination (pointillés violets) avec :

  • des atomes d'oxygène de groupes phosphate de nucléotides (astérisques) de cette région
  • un atome d'oxygène non-pontant du site d'épissage
  • un groupement OH d'une adénosine (A) de l'intron

Monde ARN RNA world protein DNA ribozyme riboswitche hammerhead pistol twister sister Varkud hatchet self cleaving scission lariat intron Gilbert base phosphate phosphodiester nucleotide nucleoside ribonucleotide biochimej

Source : Strobel S.A. (2013)

Figure b : analogie avec le snRNA U6. Il a été montré que le snRNA de U6 (qui forme une structure en épingle à cheveux semblable à celle du domaine V) du spliceosome de la levure fournit un très grand nombre d'atomes d'oxygène de groupements phosphate spécifiques qui se lient aux deux ions métalliques catalytiques du site actif, de manière similaire à la coordination des ions métalliques des introns de groupe II (Fica et al., 2013).

Ces résultats :

  • sont en faveur de l'hypothèse générale que l'épissage des pré-ARNm est fondamentalement une réaction catalysée par les ARN.
  • indiquent aussi que les introns de groupe II et le spliceosome ont un mécanisme catalytique commun et probablement des origines communes en terme d'évolution.

Voir un cours sur le spliceosome.

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b. Rôle du lariat dans l'épissage des introns de groupe II

Figure ci-dessous : structure (résolution 3.7 Å) de l'intron du groupe IIB P.li.LSUI2 de l'algue brune Pylaiella littoralis. Cet intron est sous sa forme lariat post-catalytique avec l'exon (produit) lié. C'est la première structure d'une molécule d'ARN 2′-5′.

Monde ARN RNA world protein DNA ribozyme riboswitche hammerhead pistol twister sister Varkud hatchet self cleaving scission lariat intron Gilbert base phosphate phosphodiester nucleotide nucleoside ribonucleotide biochimej

Source : Robart et al. (2014)

Il existe 3 classes structurales d'introns du groupe II (IIA, IIB et IIC). Les introns du groupe II possèdent la séquence consensus GUGYG (avec Y = U ou C).

Les interactions tertiaires sont indiquées par des lettres grecques et les domaines par des chiffres romains.

  • Le domaine V hautement conservé constitue le site actif de l'intron du groupe II. Il fixe des ions métalliques catalytiques contraignant.
  • Le domaine VI contient l'adénosine "bombée" utilisée comme nucléophile lors de la première étape de l'épissage.

Les introns de groupe II (ribozymes) catalysent leur propre retrait de l'ARN et joignent les séquences exoniques flanquantes.

biochimej ARN RNA epissage alternatif intron group II ribozyme self splicing snRNA spliceosome exon lariat

Source : Batey R. (2014)

Rappel des séquences consensus de pré-ARNm qui subissent un épissage : BPS : "branch point sequence" - 5'SS : "5' splicing site" - 3'SS : "3' splicing site".

1ère étape de l'épissage : le groupe hydroxyle d'une adénosine (A) du BPS de l'intron attaque la liaison phosphodiester du site 5'SS, ce qui forme :

  • un exon 5′ libre
  • une structure dans laquelle l'extrémité 5′ de l'intron est liée à l'adénosine qui attaque via une liaison phosphodiester 2′ - 5′ nouvellement formée.

2ème étape : le groupe hydroxyle 3′ de l'exon 5′ attaque la liaison phosphodiester sur le site 3'SS, ce qui forme :

  • le produit de ligation, au sein duquel les exons sont réunis
  • la forme lariat de l'intron

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8. Les riboswitches

Les riboswitches sont des domaines d'ARN messagers qui se lient spécifiquement à un métabolite : cette fixation induit un changement de leur conformation. L'équilibre entre ces conformations (états lié et non lié) régulent divers processus liés à la transcription des gènes et / ou à la traduction des ARN messagers, sans l'intervention de protéines. C'est un mode de régulation rétro-actif ("feedback control") de la synthèse de certains métabolites (synthèse de certains acides aminés, des purines, ...).

  • Processus régulés observés ou prédits : terminaison de la transcription, initiation de la traduction, contrôle de l'épissage chez les eucaryotes.
  • Processus régulés observés ou prédits chez certaines bactéries : interférence de transcription ou action antisens, double transcription et contrôle de la traduction, action du ribozyme auto-clivant dépendant du ligand.

Les riboswitches ont pour l'instant été mis en évidence essentiellement chez les bactéries bien qu'il y ait des exemples chez certains archées, champignons et plantes. Ils ont été découverts en 2002 (Nahvi et al., Mironov et al.).

Les riboswitches sont la preuve que l'ARN fixe spécifiquement des métabolites, propriété d'ordinaire associée aux protéines ou aux ARN artificiels (les aptamères). Les riboswitches renforcent l'hypothèse du monde à ARN, en particulier, la nécessité que l'ARN originel ait été capable de fixer des petites molécules.

Voir un cours sur l'interférence ARN.

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a. Les classes de riboswitches

Il existe une vingtaine de classes de riboswitches. Chacune d'elle est hautement spécifique d'un métabolite ligand. Par exemple, le riboswitch sensible à la guanine fixe ce métabolite avec une affinité 105 fois supérieure à celle pour l'adénine, une différence considérable en regard de la similitude chimique et structurale de ces deux purines.

Cette sélectivité stricte est abolie par la substitution d'une seule base d'ARN dans le site de fixation du ligand. La reconnaissance extrême résulte d'une complémentarité structurale obtenue par encapsulation complète du ligand dans le riboswitch, ce qui crée des interactions spécifiques avec l'ARN.

Type de ligand Ligand Classe du riboswitch Famille RFAM
Coenzyme S-adénosylmethionine (SAM) SAM/SAM-I (PDB 2GIS) RF00162
SAM/SAM-II RF00521
SAM/SAM-III (SMKbox) (PDB 3E5C) RF01767
SAM/SAM-IV RF00634
SAM/SAM-V RF01826
S-adénosylcystéine (SAH) SAH (PDB 3NPN) RF01057
SAM et SAH SAM/SAH (PDB 6HAG) RF01727
thiamine pyrophosphate TPP (PDB 2GDI) RF00059
flavine mononucléotide FMN (PDB 3F2Q) RF00050
acide tétrahydrofolique THF (PDB 3SD3) RF01831

Base azotée
nucléoside

guanine Purine / G (PDB 4FE5) RF00167
adénine Purine / A
ZTP et ZMP ZMP/ZTP (PDB 5BTP) RF01750
2'-désoxyguanosine Purine / di-GMP-I cyclique (PDB 3Q3Z) RF01051
Purine / di-GMP-II cyclique
Mesoplasma florum (PDB 3SKI) RF01510

pré-queuosine

preQ1-II (PDB 2L1V) RF01054
preQ1-III RF02680
Acide aminé glycine Glycine (PDB 3OXM) RF00504
lysine Lysine (PDB 3DOU) RF00168
glutamine glnA (PDB 5DDR) RF01739
Vitamine vitamine B12 Adenosylcobalamine (AdoCbl) (PDB 4FRN) RF00174
Ion manganèse yybP-ykoY (PDB 2QBZ) RF00080
fluorure crcB (PDB 4ENC) RF01734
nickel ou cobalt NiCo (PDB 4RUM) RF02683
Ribozyme glmS glmS (glucosamine 6-phosphate) (PDB 2NZ4) RF00234
Antibiotique néomycine, ribostamycine, paromomycine riboswitch synthétique N1 (2N0J et 2MXS) -----
ZTP (5-aminoimidazole-4-carboxamide riboside 5'-triphosphate) et ZMP (5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucléotide ou AICAR) sont des purines modifiées, intermédiaires de la voie de biosynthèse des purines. Pré-queuosine : 7-aminoéthyl 7-déazaguanine.

La thiamine pyrophosphate (TPP) et la S-adénosylmethionine (SAM) sont plus complexes que les purines du point de vue chimique et structural. En particulier, TPP porte 2 groupes phosphate chargés négativement. Or, les molécules qui se fixent à l'ARN - chargé négativement - portent en général des groupes chargés positivement (interactions électrostatiques).

Monde ARN RNA world ribozyme riboswitche thiamine pyrophosphate TPP adenosylmethionine SAM clivage self cleaving catalyse base phosphate phosphodiester nucleotide nucleoside ribonucleotide biochimej

Les régions qui fixent TPP recrute des ions métalliques chargés positivement qui assurent la médiation de ces interactions électrostatiques. Tout comme la guanine ou l'adénine au sein des riboswitches sensibles aux purines, TPP et SAM sont alors profondément enfouis entre des hélices de l'ARN en interaction. Ce mode de reconnaissance du ligand, qui résulte de la flexibilité conformationnelle de l'ARN qui lui permet d'encapsuler le ligand, semble un mécanisme commun aux différentes classes de riboswitches.

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b. Mécanisme

Les riboswitches sont donc des éléments génétiques cis-régulateurs que l'on trouve le plus souvent dans la région non traduite en 5' ("5'-UnTranslated Region" - 5'UTR) de l'ARN messager.

Monde ARN RNA world ribozyme riboswitche thiamine pyrophosphate TPP adenosylmethionine SAM clivage self cleaving catalyse base phosphate phosphodiester nucleotide nucleoside ribonucleotide biochimej

Source : Edwards et al. (2010)

Ces ARN se lient spécifiquement à de nombreux types de ligands : la liaison stabilise un certain état conformationnel ou provoque un changement conformationnel qui active ou désactive l'expression du gène en aval associé.

Les riboswitches sont composés de 2 domaines :

Monde ARN RNA world ribozyme riboswitche thiamine pyrophosphate TPP adenosylmethionine SAM clivage self cleaving catalyse base phosphate phosphodiester nucleotide nucleoside ribonucleotide biochimej

Source : Edwards et al. (2010)

  • Le domaine aptamère fixe spécifiquement un ligand : cette fixation stabilise un état conformationnel ou provoque un changement de conformation qui active ou désactive la transcription du gène associé en aval. Les séquences et les structures des domaines aptamères sont hautement conservées.
  • Le domaine plate-forme d'expression contrôle la transcription des gènes du fait de son aptitude à adopter 2 structures secondaires distinctes en réponse à la fixation du ligand.
    1. Lorsque le métabolite n'est pas lié (-M), la plate-forme d'expression (en bleu) incorpore la séquence de commutation (en violet) dans une [tige-boucle] anti-terminateur (AT) et la transcription s'effectue dans la région codante de l'ARN messager.
    2. Lorsque le métabolite se lie (+M), la séquence de commutation est incorporée dans le domaine aptamère (en rouge) et la plate-forme d'expression se replie dans un terminateur [tige-boucle] (T) interrompant la transcription.

 

9. Liens Internet et références bibliographiques

"Rfam : The Rfam database is a collection of RNA families"

"RNA Splicing"

RFAM

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