Optimisation des conditions d'expression de l'HSP22 recombinante du pois

chez Escherichia coli B834(DE3)pLysS

I. Présentation générale des chaperonnes moléculaires

II. L'HSP22 de mitochondries de feuilles de pois (Pisum sativum)

III. Le système d'expression de l'HSP22 recombinante

IV. Purification de l'HSP22 recombinante exprimée chez E. coli B834(DE3)pLysS

 

I. Présentation générale des chaperonnes moléculaires

Dans la cellule, les conditions physiologiques ne permettent pas à toutes les chaînes polypeptidiques de se replier sans assistance.

Il existe un groupe de protéines dont le rôle est d'aider certaines autres protéines à se replier, et c'est pour cette raison qu'elles ont été dénommées "chaperonnes moléculaires" (Ellis, 1987).

Les chaperonnes existent dans toutes les cellules (eucaryotes et procaryotes) quelles que soient les conditions, mais on ne les a mises en évidence qu'à la suite d'une modification temporaire de la température optimale pour l'existence de la levure.

Il y a donc une synthèse accrue des chaperonnes moléculaires après un choc thermique, mais également après d'autres types de stress comme le stress oxydatif, le déficit en eau ou l'élévation de salinité. Le froid induit la synthèse de protéines appelées " Cold Induced Protein ", en nombre plus restreint et de masse molaire plus élevée.

Cette profonde altération du profil protéique d'un organisme en réponse à un stress (c'est-à-dire le type de chaperonne(s) moléculaire(s) nouvellement synthétisée(s) ou sur-exprimée(s)), est spécifique non seulement de l'organisme considéré mais également, au sein d'une cellule, des compartiments qui la composent.

 


II. L'HSP22 de mitochondries de feuilles de pois (Pisum sativum)

a. La séquence nucléotidique du précurseur et de la forme mature de l'HSP22

La séquence qui code pour le précurseur de l'HSP22 de mitochondries de feuilles de pois présente les caractéristiques suivantes :

  • (i) une région 5' non traduite de 132 nucléotides ;
  • (ii) un codon d'initiation de la traduction ATG (début en position 133) inclu dans la séquence " CTCA ATGGC ", séquence consensus pour le site d'initiation de la traduction des gènes nucléaires de plantes ;
  • (iii) un codon de terminaison de la traduction (TAG) qui débute en position 739 ;
  • (iv) une région 3' non traduite de 139 nucléotides suivie par une queue poly(A)+ qui ne présente pas de site de poly-adénylation, comme beaucoup de gènes d'HSP de plantes.

C'est la séquence qui code la forme mature de l'HSP22 qui a été clonée dans le vecteur pET-3a.

b. La séquence polypeptidique du précurseur et de la forme mature de l'HSP22

L'HSP22 précurseur est une protéine de 202 acides aminés d'une masse molaire apparente de 22,9 kDa, dont les caractéristiques sont les suivantes :

  • (i) la séquence débute par Met - Ala comme la plupart des protéines de plantes ;
  • (ii) l'analyse informatique prédit un peptide signal de 32 acides aminés ;
  • (iii) ce peptide signal a un contenu élevé en Ser (sites potentiels de phosphorylation) et en résidus basiques (Arg & Lys), mais pas en résidus acides (Asp & Glu) ;
  • (iv) la prédiction de structures secondaires indique la possibilité d'une hélice a trans-membranaire impliquant les résidus 2 à 21 (Lenne et al., 1995).

La protéine sur-exprimée (la forme mature de l'HSP22) contient 170 acides aminés pour une masse molaire prédite de 19,5 kDa. L'extrémité N-terminale de la protéine purifiée à partir des mitochondries est l'Asn 33 (Lenne & Douce, 1994).

L'extrémité N-terminale de la protéine recombinante purifiée a été séquencée. Du fait de la construction dans le vecteur et donc la présence du codon d'initiation de la traduction (ATG), il y a une méthionine additionnelle avant l'asparagine 33 (premier acide aminé de la forme mature de l'HSP22).

 


 

III. Le système d'expression de l'HSP22 recombinante

La souche utilisée, B834(DE3)pLysS, est un dérivé lysogène de la souche classique E. coli B, c'est-à-dire qu'elle contient le prophage lDE3 dont l'un des gènes code l'ARN polymérase du bactériophage T7.

Ce gène est sous le contrôle du promoteur lacUV5 inductible par l'IPTG. Ainsi, quand ces souches sont transformées par un vecteur d'expression (comme ceux de la famille pET) qui contient un promoteur fort (celui du bactériophage T7), la synthèse d'ARNm est accrue et la synthèse de la protéine d'intérêt peut atteindre une proportion de 40% à 50% des protéines totales (Baneyx, 1999).

Cependant, dans le cas de promoteurs forts, il y a une expression de base en absence d'inducteur. Cette " fuite " peut avoir 2 conséquences :

  • (i) une instabilité du vecteur et son éventuelle expulsion de la cellule hôte ;
  • (ii) une teneur élevée en ARNm qui peut détruire les ribosomes et donc tuer la cellule hôte, avant l'induction de l'expression de la protéine recombinante.
L'une des stratégies adoptées pour palier à ces problèmes est la co-sur-expression du lysozyme du bactériophage T7, dont le gène est porté par un plasmide additionnel, pLysS. En effet, le lysozyme est un inhibiteur de l'ARN polymérase du bactériophage T7, ce qui diminue le niveau de base de la transcription. De plus, l'attaque du peptidoglycane de la membrane externe de E. coli par le lysozyme est très limitée car celui-ci ne peut pas franchir la membrane interne de la bactérie.

Une autre caractéristique importante de cette souche (et de toute souche dérivée de BL21) est qu'elle ne possède pas les gènes ompT et lon qui codent pour des protéases qui dégraderaient la protéine sur-exprimée.

La souche B834 est une souche parentale de BL21, auxotrophe pour la méthionine. 

La séquence codant la forme mature de l'HSP22 a été clonée dans le vecteur pET-3a entre les sites Nde I et BamH I.

  • séquence insérée :     5'             229AAC  ACC    ..........     GAT     TAG741 3'
  • qui code pour : +3HN - Asn33- Thr34 -  ......... - Asp202Stop

 

 

IV. Purification de l'HSP22 recombinante exprimée chez E. coli B834(DE3)pLysS

Accumulation de protéine surexprimée sous forme de corps d'inclusion.

Effet des composants du milieu de lyse sur les constituants de la membrane.