Etude d'une protéine à régulation allostérique : l'hémoglobine
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La fixation réversible de l'oxygène sur l'hème de l'hémoglobine peut être décrite de la manière suivante :

déoxyhémoglobine + 4 O2 <========> Oxyhémoglobine

L'hémoglobine peut aussi fixer réversiblement le CO2, les ions H+ et Cl- et le 2-3 biphosphoglycérate (BPG).

Par la suite, on utilisera les appellations suivantes :

  • hémoglobine : forme quelconque de cette protéine (non oxygénée; partiellement oxygènée ; totalement oxygènée).
  • déoxyhémoglobine = Hb : forme non oxygénée.
  • oxyhémoglobine = Hb(O2)4 : forme totalement oxygènée.
  • oxyhémoglobine = (Hb(O2)xi) : forme partiellement oxygènée à une pression quelconque i en oxygène (pO2i), x étant la stoechiométrie de l'oxygène fixé par molécule de protéine.

1. Fixation du BPG sur la déoxyhémoglobine

Cette fixation est étudiée par la technique de la dialyse à l'équilibre. On utilise 6 cellules de dialyse, constituées de deux compartiments A et B, de même volume (500 µL), séparés par une membrane semi-perméable.

Au temps t = 0 de l'expérience, on introduit:

  • dans le compartiment A des 6 cellules : du 32P-BPG à différentes concentrations [BPG]0. La radioactivité spécifique de cette molécule est de 1,5 Ci.mole-1 (1 Ci = 2,2 1012 désintégrations par minute (dpm)).
  • dans le compartiment B des 6 cellules : de l'Hb à la concentration [Hb]0 = 10-5 M. 

Les cellules de dialyse sont placées à 4°C et agitées doucement jusqu'à ce que l'équilibre de dialyse soit atteint. On récupère alors le contenu de chacun des deux compartiments des 6 cellules et on compte la radioactivité.

Les valeurs sont les suivantes : 

cellule de dialyse 1 2 3 4 5 6
radioactivité compartiment A (dpm) 4050 6830 14025 29120 61000 158400
radioactivité compartiment B (dpm) 5870 9650 19025 36860 71800 172050

1. Décrivez cette expérience. Que contiennent les compartiments A et B, respectivement au temps t = 0 et à l'équilibre de dialyse ? Comment s'assurer que cet équilibre est atteint ?

2. Tracez la courbe : [BPGlié]/[Hb]0 = f([BPGlibre]). A quel phénomène l'allure de cette courbe vous fait-elle penser ?

3. En utilisant la représentation de Scatchard : ν/[BPGlibre] = f([BPGlié]) avec ν = [BPGlié]/[Hb]0 , déterminez le nombre de site(s) de fixation du BPG sur l'Hb et la valeur de la constante de dissociation KD.

4. Interprétez ces résultats d'un point de vue physiologique.


2. Fixation de l'oxygène sur l'hémoglobine

La figure ci-dessous représente les spectres d'absorption d'une solution de Hb et d'une solution de Hb(O2)4, la concentration en protéine de chacune de ces solutions étant 10-4 M.

La figure ci-dessous représente le spectre de différence d'absorption entre ces deux solutions, celle d'Hb étant la solution de référence.

spectre absorption absorbance Hemoglobine haemoglobin allosterie allostery equilibre fixation bisphosphoglycerate oxygene hemoglobine oxyhemoglobine ligand dialyse Scatchard biochimej

spectre absorption absorbance Hemoglobine haemoglobin allosterie allostery equilibre fixation bisphosphoglycerate oxygene hemoglobine oxyhemoglobine ligand dialyse Scatchard biochimej

1. Expliquez la procédure utlisée pour obtenir un tel spectre. Quelle est la longueur d'onde qui reflète le changement de conformation induit par l'oxygénation de l'hémoglobine ? A quoi est dû ce changement de conformation ?

2. A 560 nm, ε est le coefficient d'extinction molaire de l'Hb et ε' celui de l'Hb(O2)4. Calculez la différence entre ces deux coefficients, Δε560, sachant que l = 1 cm.

3. On étudie le mécanisme de fixation de l'oxygène sur l'Hb par cette technique, dans deux conditions: l'expérience 1 et l'expérience 2 sont réalisées respectivement en absence et en présence de BPG.

Pour chaque valeur de pression partielle en oxygène, on enregistre la valeur de la différence d'absorption à 560 nm entre la solution d'hémoglobine de plus en plus saturée en oxygène et une solution de référence d'Hb.

Pour toutes les expériences, la concentration totale d'hémoglobine dans chaque cuve est 6 10-5 M.


Les résultats de l'expérience 1 sont les suivants :

pO2 (mm Hg) 0,25 0,4 0,65 1 1,6 2,2 2,5 2,8 3,2
- ΔA560 0,003 0,004 0,007 0,014 0,032 0,057 0,078 0,100 0,120
pO2 (mm Hg) 3,8 4 5 6,3 10 16 25 40 50
- ΔA560 0,140 0,160 0,180 0,210 0,222 0,228 0,231 0,232 0,232

Les résultats de l'expérience 2 sont les suivants :

pO2 (mm Hg) 3,5 5 6,5 7,5 8,5 9,5 11 13,6 16 18,5 50
- ΔA560 0,023 0,047 0,076 0,097 0,127 0,137 0,164 0,190 0,207 0,221 0,232

3a. Pourquoi les valeurs de différence d'absorption à 560 nm sont-elles affectées d'un signe négatif ?

3b. Tracez les courbes: -ΔA560 = f(pO2) et commentez leur allure.

3c. On définit : Y = fraction d'hémoglobine oxygénée à une pression pO2 quelconque = [O2]lié/(n . [Hb]0) avec n = 4 sites de fixation de l'oxygène. Tracez les courbes: Y = f(pO2) pour les expériences 1 et 2.

3d. Déterminez pour ces deux expériences le pourcentage d'oxygène fixé à l'hémoglobine qui est libéré quand la pression d'oxygène passe de pO2 = 50 mm Hg (pression partielle au niveau des poumons) à pO2 = 5 mm Hg (pression partielle au niveau des muscles). Quelle précision quant au rôle physiologique du BPG ces résultats mettent-ils en évidence ?


3. Représentation et coefficient de Hill et représentation de Scatchard

1. Pour rendre compte de l'allure sigmoïdale des courbes de saturation, Hill a proposé en 1910 une relation empirique qui, dans le cas de l'Hb, s'écrit :

Hemoglobine haemoglobin allosterie allostery equilibre fixation bisphosphoglycerate oxygene hemoglobine oxyhemoglobine ligand dialyse Scatchard biochimej   =

                [pO2]nH 
------------------------------------- 
   [pO2]1/2nH   +   [pO2]nH

nH est le coefficient de Hill ou indice de coopérativité. nH est différent du nombre de site de fixation du ligand.

  • 1a. Proposez une représentation graphique permettant de déterminer nH.
  • 1b. Quelle partie du graphe obtenu faut-il utiliser pour calculer nH ?
  • 1c. Calculez nH pour l'hémoglobine en absence et en présence de 2,3-BPG.

2. On appelle Hemoglobine haemoglobin allosterie allostery equilibre fixation bisphosphoglycerate oxygene hemoglobine oxyhemoglobine ligand dialyse Scatchard biochimej le nombre moyen de molécules d'oxygène fixées par molécule d'Hb.

  • 2a. Sachant qu'il y a quatre sites de fixation de l'oxygène sur l'hémoglobine, quelle est la relation entre Hemoglobine haemoglobin allosterie allostery equilibre fixation bisphosphoglycerate oxygene hemoglobine oxyhemoglobine ligand dialyse Scatchard biochimej et Hemoglobine haemoglobin allosterie allostery equilibre fixation bisphosphoglycerate oxygene hemoglobine oxyhemoglobine ligand dialyse Scatchard biochimej ?
  • 2b. Tracez la courbe : Hemoglobine haemoglobin allosterie allostery equilibre fixation bisphosphoglycerate oxygene hemoglobine oxyhemoglobine ligand dialyse Scatchard biochimej = f(pO2. Tracez la représentation de Scatchard correspondant. Commentez l'allure des courbes.

 

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