La fixation réversible de l'oxygène sur l'hème de l'hémoglobine peut être décrite de la manière suivante : déoxyhémoglobine + 4 O₂ <=> oxyhémoglobine

L'hémoglobine peut aussi fixer réversiblement le CO₂, les ions H⁺ et Cl^- et le 2-3 biphosphoglycérate (BPG).

Par la suite, on utilisera les appellations suivantes :

• hémoglobine : forme quelconque de cette protéine (non oxygénée; partiellement oxygènée ; totalement oxygènée).
• déoxyhémoglobine = Hb : forme non oxygénée.
• oxyhémoglobine = Hb(O₂)₄ : forme totalement oxygènée.
• oxyhémoglobine = (Hb(O₂)_xi) : forme partiellement oxygènée à une pression quelconque i en oxygène (pO₂ⁱ), x étant la stoechiométrie de l'oxygène fixé par molécule de protéine.

A. Etude de la fixation du BPG sur la déoxyhémoglobine

Cette fixation est étudiée par la technique de la dialyse à l'équilibre. On utilise 6 cellules de dialyse, constituées de deux compartiments A et B, de même volume (500 µL), séparés par une membrane semi-perméable.

Au temps t = 0 de l'expérience, on introduit:

• dans le compartiment A des 6 cellules : du ³²P-BPG à différentes concentrations [BPG]₀. La radioactivité spécifique de cette molécule est de 1,5 Ci.mole^-1 (1 Ci = 2,2 10¹² désintégrations par minute (dpm)).

• dans le compartiment B des 6 cellules : de l'Hb à la concentration [Hb]₀ = 10^-5 M. 

Les cellules de dialyse sont placées à 4°C et agitées doucement jusqu'à ce que l'équilibre de dialyse soit atteint. On récupère alors le contenu de chacun des deux compartiments des 6 cellules et on compte la radioactivité.

Les valeurs sont les suivantes : 

1. Décrire cette expérience. Que contiennent les compartiments A et B, respectivement au temps t = 0 et à l'équilibre de dialyse ? Comment s'assurer que cet équilibre est atteint ?

2. Tracer la courbe : [BPG_lié]/[Hb]₀ = f([BPG_libre]). A quel phénomène l'allure de cette courbe vous fait-elle penser ?

3. En utilisant la représentation de Scatchard : ν/[BPG_libre] = f([BPG_lié]) avec ν = [BPG_lié]/[Hb]₀ , déterminer le nombre de site(s) de fixation du BPG sur l'Hb et la valeur de la constante de dissociation K_D.

4. Interprétez ces résultats d'un point de vue physiologique.

B. Etude de la fixation de l'oxygène sur l'hémoglobine

Les figures ci-dessous représentent :

• A : les spectres d'absorption d'une solution de Hb et d'une solution de Hb(O₂)₄, la concentration en protéine de chacune de ces solutions étant 10^-4 M.
• B : le spectre de différence d'absorption entre ces deux solutions, celle d'Hb étant la solution de référence.

1. Expliquez la procédure utlisée pour obtenir un tel spectre. Quelle est la longueur d'onde qui reflète le changement de conformation induit par l'oxygénation de l'hémoglobine ? A quoi est dû ce changement de conformation ?

2. A 560 nm, ε est le coefficient d'extinction molaire de l'Hb et ε' celui de l'Hb(O₂)₄. Calculez la différence entre ces deux coefficients, Δε₅₆₀, sachant que l = 1 cm.

Pour toutes les expériences, la concentration totale d'hémoglobine dans chaque cuve est 6 10^-5 M.

3. On étudie le mécanisme de fixation de l'oxygène sur l'Hb par cette technique, dans deux conditions: l'expérience 1 et l'expérience 2 sont réalisées respectivement en absence et en présence de BPG.

• Pour chaque valeur de pression partielle en oxygène, on enregistre la valeur de la différence d'absorption à 560 nm entre la solution d'hémoglobine de plus en plus saturée en oxygène et une solution de référence d'Hb.
• Pour toutes les expériences, la concentration totale d'hémoglobine dans chaque cuve est 6 10^-5 M.

Les résultats de l'expérience 1 sont les suivants :

Les résultats de l'expérience 2 sont les suivants :

3a. Pourquoi les valeurs de différence d'absorption à 560 nm sont-elles affectées d'un signe négatif ?

3b. Tracez les courbes: -ΔA₅₆₀ = f(pO₂) et commentez leur allure.

3c. On définit : Y = fraction d'hémoglobine oxygénée à une pression pO₂ quelconque = [O₂]_lié/(n . [Hb]₀) avec n = 4 sites de fixation de l'oxygène. Tracez les courbes: Y = f(pO₂) pour les expériences 1 et 2.

3d. Déterminez pour ces deux expériences le pourcentage d'oxygène fixé à l'hémoglobine qui est libéré quand la pression d'oxygène passe de pO₂ = 50 mm Hg (pression partielle au niveau des poumons) à pO₂ = 5 mm Hg (pression partielle au niveau des muscles). Quelle précision quant au rôle physiologique du BPG ces résultats mettent-ils en évidence ?

C. Représentation et coefficient de Hill et représentation de Scatchard

1. Pour rendre compte de l'allure sigmoïdale des courbes de saturation, Archibald Hill a proposé en 1910 une relation empirique qui, dans le cas de l'Hb, s'écrit :

                     [pO₂]^nH 
Y_S = -------------------- 
          [pO₂]_1/2^nH + [pO₂]^nH

n_H est le coefficient de Hill ou indice de coopérativité. n_H est différent du nombre de site de fixation du ligand.

• 1a. Proposez une représentation graphique permettant de déterminer n_H.
• 1b. Quelle partie du graphe obtenu faut-il utiliser pour calculer n_H ?
• 1c. Calculez n_H pour l'hémoglobine en absence et en présence de 2,3-BPG.

2. On appelle le nombre moyen de molécules d'oxygène fixées par molécule d'Hb.

• 2a. Sachant qu'il y a quatre sites de fixation de l'oxygène sur l'hémoglobine, quelle est la relation entre et ?
• 2b. Tracez la courbe : = f(pO₂. Tracez la représentation de Scatchard correspondant. Commentez l'allure des courbes.