Quelques techniques de fluorescence pour l'hybridation in situ

a. Principe physique de la fluorescence

b. Le 4',6-diamidino-2-phenylindole ou DAPI®

c. La technique du FISH

d. La technique du FRET

e. La technique GFP

f. La technique GFP appliquée au chloroplastes

g. Les puces à ADN

h. Autres techniques biophysiques

i. Références bibliographiques

a. Principe de la fluorescence

Une molécule fluorescente (fluorophore ou fluorochrome) possède la propriété d'absorber de l'énergie lumineuse (lumière d'excitation) et de la restituer rapidement (< 1 nsec) sous forme de lumière fluorescente (lumière d'émission).

Pour qu'une molécule passe de l'état fondamental à un état excité, il faut qu'il reçoive une quantité d'énergie équivalente à la différence entre ces deux niveaux.

Pour une molécule complexe comme une protéine, les niveaux S0 et S'1 sont multiples, et il y a des pertes au sein de la molécule lors du retour d'un état excité S1' à un état excité S1 (exemple ci-contre).

En conséquence, l'énergie d'émission est toujours plus faible que l'énergie d'excitation. Ce qui se traduit par :

E_emission = h/l_em < E_excitation = h/l_exc

La longueur d'onde de la lumiére d'émission est toujours plus élevée que celle de la lumiére d'excitation.

Source : "La microscopie confocale"

b. Le 4',6-diamidino-2-phenylindole ou DAPI®

Spectre d'émission de fluorescence du 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI®) dissout dans le diméthyl sulfoxyde (DMSO).

La longueur d'onde d'excitation est 310 nm.

Le DAPI® est utilisé en cytochimie car il marque l'ADN qui fluoresce en bleu.

Voir une application : au cours de la mitose l'ADN (chromatine) est essentiellement localisé dans les noyaux.

Bibliographie : Du et al. (1998) "PhotochemCAD: A computer-aided design and research tool in photochemistry" Photochemistry and Photobiology 68, 141 - 142

Source : "Oregon Medical Laser Center"

c. La technique du FISH

La technique du FISH (hybridation in situ avec des sondes fluorescentes - "Fluorescence In Situ Hybridization") sert à marquer des séquences d'un gène ou d'une partie du génome par appariement d'une sonde nucléotidique avec sa séquence homologue sur le chromosome.

Elle est utilisée pour déceler les anomalies chromosomiques (recombinaison chromosomique) et faire de la cartographie des génes.

Voir un développement de cette technique et de ses applications.

Source : "Access Excellence @ the national health museum"

d. La technique du FRET (transfert d'énergie de résonnance de fluorescence - "Fluorescence Resonance Energy Transfer")

Elle utilise deux fluorochromes : un donneur qui va transmettre son énergie à un autre fluorochrome accepteur. Elle permet d'étudier des interactions entre deux molécules.

Dans l'exemple ci-contre, on observe un phénomène de FRET entre l'anticorps anti-synucléine (marqué à la fluorescéine) et l'anticorps anti-HSP ("heat shock protein"), marqué à la cyanine 3 (fluorescence verte) dans toute la cellule et en particulier dans les corps d'inclusion formés par les aggrégats protéiques.

En revanche, il y a peu de FRET dans le noyau.

Auteur : B. Bacskai (Massachusetts General Hospital, USA)

Source : ZEISS. Ltd

e. La technique GFP (protéine fluorescente verte - "Green Fluorescent Protein")

Cette technique consiste à intégrer dans le génome de la cellule à observer un géne de protéine fluorescente, la protéine synthétisée est alors fluorescente.

La GFP (238 acides aminés) est utilisée en hybridation in situ pour l'étude de l'expression des génes, la localisation de protéines dans les cellules ...

• longeur d'onde d'excitation de fluorescence : 395 nm
• longeur d'onde d'émission de fluorescence : 508 nm

Voir le "GFP site".

Bibliographie : Tsien R. Y. (1998) "The Green Fluorescent Protein" Annu. Rev. Biochem. 67, 509 - 544

Source : "Introduction to Biological Imaging"