1. Introduction

2. Préparation des échantillons et hybridation

3. L'analyse des données

a. La détection du signal et l'analyse d'images

b. Le traitement des données brutes

c. Analyse des données : la prédiction

4. L'interprétation biologique des données: l'ontologie et l'annotation

5. "Chromatin ImmunoPrecipitation on Chip"

6. Comparaison des puces à ADN et de la technique de séquençage "RNA-seq"

7. Liens Internet et références bibliographiques

1. Introduction

Préambule : les nouvelles technologies de séquençage à trés hauts débits vont-elles rendre caduques les approches telles que les puces à ADN, "Chip on Chip" ou EST ?

Il y a des arguments pour (à long terme) et contre (l'acquis via les puces à ADN ou EST et la précision de cet acquis). Voir le chapitre "Comparaison puces à ADN et RNA-seq".

A titre historique et conceptuel, il est malgré tout important de connaître les principes des études du transcriptome par la technique des puces à ADN.

La première puce à ADN (figure ci-dessous) avec 45 sondes fluorescentes d'Arabidopsis thaliana est apparue en 1995 (Schena et al. (1995) Science 270, 467 - 470).

Le développement des puces à ADN sur membrane de nylon puis sur lame de verre a permis d'obtenir des mesures massivement parallèles de la concentration des ARN messagers d'une cellule dans un état physiologique donné.

Diverses techniques permettaient à cette époque d'aborder l'étude de l'expression des gènes :

• la technique dite "northern blot"
• la transcription inverse suivie de réactions de polymérisation en chaîne ("reverse transcription polymerase chain reactions", RT-PCR)

Cependant la principale avancée des puces à ADN a été de changer d'échelle : l'analyse simultanée de l'ensemble de tous les transcrits d'un génome.

La technologie des puces à ADN a permis de générer des "images" de l'état de l'expression des gènes d'une cellule.

L'application immédiate a été d'améliorer et de préciser le diagnostic, le pronostic et l'orientation thérapeutique dans le cas de pathologies diverses.

Les puces à ADN sont des lames de verre activées sur lesquelles sont déposées de nombreuses copies d'une séquence d'ADN spécifique d'un gène donné (figure ci-dessous).

Source : Frouin & Gidrol (2005) Biofutur 252

Exemples de puces à ADN pour l'étude du transcriptome d'Arabidopsis thaliana

1. La puce CATMA ("Complete Arabidopsis Transcriptome MicroArray" - 2006)

Elle contient 30 886 GSTs (étiquettes spécifiques de gènes - "Gene-specific Sequence Tags") étiquetant la majorité des gènes prédits chez Arabidopsis thaliana. Les GSTs sont des fragments génomiques de 150 à 500 paires de base amplifiés par réaction de polymérisation en chaîne (voir la position des GST).

Au maxium, 50% de ces paires de base doivent être des séquences d'introns. Par ailleurs, elles ont été sélectionnées de sorte que leurs séquences ne présentent pas plus de 70% d'identité avec n'importe quelle autre séquence du génome d'Arabidopsis thaliana.

La puce CATMA est complétée par 615 sondes spécifiques des génomes chloroplastique et mitochondrial. Cette puce permet :

• de découvrir de nouveaux gènes chez Arabidopsis thaliana
• l'étude d'un trés grand nombre de gènes différentiellement transcrits selon les organes et dans des conditions de stress biotiques et abiotiques.
• Aubourg et al. (2007) "Analysis of CATMA transcriptome data identifies hundreds of novel functional genes and improves gene models in the Arabidopsis genome" BMC Genomics 8, 401

La base de données CATdb :

• rassemble les résultats obtenus avec la puce CATMA
• a été développée à l'Unité de Recherche en Génomique Végétale / INRA- Versailles (URGV)
• Gagnot et al. (2008) "CATdb: a public access to Arabidopsis transcriptome data from the URGV-CATMA platform" Nucleic Acids Research 36, D986-D990

2. Une puce dite "chromosomique"

• Elle est constituée de 20 500 produits PCR (taille moyenne 1 Kb) choisis pour couvrir l'intégralité des 17 millions de paires de base séquencées du chromosome IV d'Arabidopsis thaliana sans a priori sur son annotation.
• Elle sert à établir des cartes transcriptionnelles et épigénétiques de ce chromosome (notamment par la technique d'immunoprécipitation de la chromatine dans le cas de cartes épigénétiques).
• Epigénétique et épigénomique : étude de l'influence de l'environnement et de l'histoire individuelle sur les modifications de l'expression des gènes d'une génération à l'autre. Le préfixe "épi" signifie "sur, au-dessus, ...".

3. Une puce ATH1 d'Affymetrix

Cette puce a été conçue en collaboration avec le TIGR et contient plus de 22,500 sondes oligonucléotidiques (25-mer) représentant environ 24,000 gènes d'Arabidopsis thaliana. L'interface "NetAffx Analysis Center" contient les données ATH1-12150 du TIGR et permet l'analyse des données.

Voir une comparaison des caractéristiques de la puce CATMA et d'autres puces Affymetrix ("TAIR Microarray Elements Statistics").

Tableau ci-dessous : survol des puces les plus utilisées pour l'étude de la transcription des gènes chez diverses plantes et nombre d'expériences stockées dans la base de données ArrayExpress / EBI. La puce ATH1 et la puce CATMA sont les plus utilisées et plusieurs centaines d'expériences concernant Arabidopsis ont été publiées.

Source : Baginsky et al. (2010)

2. Préparation des échantillons et hybridation

Rappel sur la transcription et la traduction

Schématiquement, les deux grandes étapes de l'ADN aux ARN messagers puis des ARN messagers aux protéines sont :

la transcription : synthèse de l'ARN messager à partir de l'ADN. Après la transcription, l'enchaînement des 4 nucléotides de l'ARN messager (C, G, A et U) correspond exactement à celui des 4 nucléotides (C, G, A et T) des exons de l'ADN.

la traduction : synthèse de la protéine à partir de l'ARN messager. L'enchaînement des nucléotides de l'ARN messager est décodé dans les ribosomes par triplet : 3 nucléotides = 1 codon. Après la traduction, l'enchaînement des 20 acides aminés de la protéine correspond exactement à celui des codons de l'ARN messager.

Les sondes

Les puces à ADN sont des lames de verre activées sur lesquelles sont déposés plusieurs milliers de "spot" d'acides nucléiques : les acides nucléiques fixés sur les puces à ADN sont appelés sondes ("probes").

• Les sondes peuvent être de l'ADN génomique (l'ensemble des gènes) ou des gènes transcrits (Expressed Sequence Tags ou EST).
• Un spot correspond à de nombreuses sondes, c'est-à-dire à de nombreuses copies d'une séquence d'ADN spécifique d'un gène donné.
• Avant l'hybridation avec les cibles (voir ci-dessous) , les sondes sont dénaturées : elles sont sous forme simple brin et peuvent ainsi s'hybrider avec le brin complémentaire d'une cible.

Voir une vidéo de la synthèse - dépôt des sondes par un robot.

Les cibles

Les acides nucléiques qui sont hybridés avec ces sondes sont appelés cibles ("targets").

Pour une exprérience donnée, une condition expérimentale (stress, pathologie, état de différenciation cellulaire, ...) est comparée à une condition de référence : les ARN messagers (les cibles) sont donc extraits des 2 types de cellules que l'on veut comparer.

Les ARN messagers sont rétro-transcrits en ADNc par une transcriptase inverse (figure ci-contre). C'est une DNA polymérase qui synthétise un brin d'ADN complémentaire (ADNc) en utilisant un brin d'ARN comme matrice.

Un hybride [premier brin d'ADNc - brin d'ARN] est ainsi formé dans un premier temps. Après synthèse du premier brin d'ADNc, le brin d'ARN matrice est hydrolysé par la RNAse H. Le second brin d'ADNc est ensuite synthétisé.

Source : "ADN recombinant", Watson et al. (1994) - Ed. DeBooeck Université

Au cours de cette rétro-transcription :

• les ADNc d'un type de cellule sont marqués par une molécule fluorescente
• les ADNc de l'autre type de cellule sont marqués par une autre molécule fluorescente

Le marquage des cibles consiste en l'incorporation de nucléotides portant :

• soit le fluorophore cyanine 3 (Cy3) sous forme de Cy3-dUTP
• soit le fluorophore cyanine 5 (Cy5) sous forme de Cy5-dUTP

Ces 2 molécules sont les plus classiquement utilisées.

Il existe 2 méthodes de marquage des cibles en fluorescence :

• directe : synthèse d'ADNc marqués par transcription reverse
• indirecte : (a) synthèse d'ADNc avec incorporation de nucléotides portant un groupement amino-allyl. (b) fixation sur les groupements allyl, de groupements ester liés au fluorochrome.

Les deux familles de cibles sont mélangées et déposées sur la lame.

S'il existe un brin d'ADN sonde complémentaire d'un brin d'ADNc cible, ils s'hybrident pour former de l'ADN double brin fluorescent.

Cette hybridation est compétitive : plus la concentration d'un ADNc cible (donc celle de l'ARN messager qui en est l'origine) est élevée, plus l'ADNc cible s'hybridera sur la sonde.

Source : Frouin & Gidrol (2005)

En conséquence, l'intensité de fluorescence traduit, respectivement :

• fluorescence verte : hybridation préferentielle d'un ADNc cible de référence (témoin)
• fluorescence rouge : hybridation préferentielle d'un ADNc cible issu de la condition expérimentale

Le rapport des intensités de fluorescence traduit donc la concentration relative des ARN messagers dans chaque condition. Ceux-ci sont soit sur-exprimés, soit exprimés de la même manière, soit sous-exprimés.

Source : Vulgariz

Voir un exemple de conditions expérimentales et de résultats d'hybridation : "Identification of genes differentially expressed between flowers and leaves".
Puce CATMA / Cy3 : feuilles / Cy5 : fleurs / Arabidopsis thaliana

3. L'analyse des données

Elle se décompose en 3 étapes :

• la détection du signal et l'analyse d'images
• le traitement des données brutes et le regroupement
• l'analyse des données sur la base, en particulier, d'algorithmes de classification

Certains outils bioinformatiques existent pour répondre à cette démarche.

Source : "L'analyse des résultats de puces à ADN" - ENS

Malgré tout, la diversité des applications des puces à ADN et des problèmatiques biologiques auxquelles elles contribuent à apporter une réponse, a nécessité le développement d'algorithmes et de logiciels spécifiques à cette technologie.

a. La détection du signal et l'analyse d'images

Lors de la lecture, chaque spot est excité par un laser et l'émission de fluorescence est mesurée. On obtient 2 images en niveaux de gris qui correspondent au mélange des fluorescences respectives des 2 fluorophores.

On remplace les niveaux de gris par :

• des niveaux de vert pour l'une des images
• des niveaux de rouge pour l'autre image

Après superposition, on obtient une image en fausses couleurs composée de spots :

• verts : seul l'ADNc cible de la condition de référence s'est hybridé aux sondes
• rouges : seul l'ADNc cible de la condition pathologique s'est hybridé aux sondes
• jaunes : les ADNc cibles des deux conditions sont hybridés aux sondes en quantités égales

Source : Frouin, V. & Gidrol, X. (2005)

Ces étapes font appel à des techniques de traitement de l'image et utilisent des algorithmes de morphologie mathématique.

Les technologies pour l'analyse des images sont de plus en plus performantes. La résolution est augmentée, en conséquence :

• le nombre de pixels utilisables pour l'analyse est augmenté
• la sensibilité du rapport [signal / bruit de fond] est augmentée

Par ailleurs, de nouvelles surfaces sont utilisées pour remplacer le verre. Par exemple, des cristaux de mélange d'oxyde de silice et de titane à fluorescence accrue.

Source : Agilent microarray technology

Source : MYcroarray

b. Le traitement des données brutes

Après l'étape d'analyse de l'image, chaque sonde est caractérisée par :

• 2 mesures (cas général) d'intensité de fluorescence (une verte et une rouge)
• 2 mesures (cas général) du "bruit de fond" : conditions expérimentales, étapes d'acquisition des données, incorporation plus facile de Cy3, ...

Les signaux rouges et vert ne peuvent être interprétés séparément. Les puces à ADN permettent de mesurer une variation de transcription d'un gène entre 2 conditions expérimentales (référence et pathologique, par exemple). Elles fournissent donc des valeurs relatives.

Pour chaque spot, le logarithme du rapport (r) de l'intensité de fluorescence de la condition pathologique sur l'intensité de fluorescence de la condition de référence est calculé (rapport fluorescence rouge / fluorescence verte) : log₂(r).

Ce rapport permet d'évaluer la différence du taux de transcription d'un gène entre les 2 échantillons biologiques étudiés.

On considère pour un rapport :

• au moins supérieur à 2, qu'un gène est sur-exprimé dans une des cibles par rapport à l'autre
• inférieur à 0,5, qu'un gène est sous-exprimé dans une des cibles par rapport à l'autre

Source : Le principe des puces à ADN (Cours ENS)

Voir un exemple : Puce CATMA / Cy3 - feuilles / Cy5 : fleurs / Arabidopsis thaliana

Normalisation des données de fluorescence

Ci-dessous : exemple de puces de 16000 oligonucléotides de Medicago truncatula et une représentation des intensités des spots.

Source : The Samuel Roberts Noble Foundation

Elle a pour but, entre autre, de distinguer les variations aléatoires (biologiques et expérimentales : celles que l'on veut mettre en évidence) des variations systématiques. Ces dernières ont pour origine en particulier :

• les différences dans les rendements de marquage par le Cy3-dUTP et le Cy5-dUTP (l'encombrement stérique de ces nucléotides est différent, voir les structures ci-dessus)
• les différences de demi-vie du Cy3-dUTP et du Cy5-dUTP
• les différences de quantités de sondes déposées par les différentes aiguilles (voir l'image ci-dessus)
• une détection des signaux de fluorescence (ou de radioactivité) qui, sur une trés large gamme, n'est pas proportionnelle aux quantités de molécules marquées
• les problèmes intrinsèques à l'analyse d'image (repérage des spots quand il y en a plusieurs dizaines de milliers sur 1 cm², distinction entre le bruit de fond et le signal spécifique, ...)

L'hypothèse de base de la normalisation est que la majorité des gènes ont un niveau d'expression invariant entre 2 conditions (référence et pathologique, par exemple), soit : log₂(r) = 0.

La normalisation a donc pour but de ramener la moyenne de cette grandeur à 0.

Exemple de valeurs normalisées : le rapport permet de mettre en évidence les gènes pour lesquels le canal rouge (condition pathologique) donne une valeur supérieure au canal vert. Le log₂(r) donne une distribution symétrique autour de zéro. Enfin, la soustraction du rapport moyen des logarithmes permet de tenir compte de l'intensité plus importante du canal rouge.

Le filtrage

Un rapport d'une valeur donnée peut être obtenu par des valeurs d'intensité [rouge/vert] trés proches du bruit de fond (peu fiables alors) ou, au contraire, trés élevées (plus significatives).
Exemple : le rapport 1,6 = (160/100) ou (16000/10000).

Le filtrage a pour but d'éliminer les sondes pour lesquelles une des mesures d'intensité de fluorescence est inférieure à un seuil (arbitraire ou déterminé à partir d'un modèle).

Risque statistique

Les traitements précédents aboutissent à une liste de rapports (r) pour chaque gène. La suite consiste à déterminer, à l'aide de logiciels utilisant des techniques statistiques, les gènes différentiellement exprimés (ceux dont les valeurs de log₂(r) sont significativement différents de 0).

Cependant, le choix d'une méthode d'analyse est liée aux conditions dans lesquelles a été menée l'expérience (réplicats, facteurs expérimentaux, ...). De plus, ces outils informatiques ne donnent pas de valeur seuil sur le résultat d'un test pour évaluer si l'expression d'un gène est modulée ou non. Il incombe à l'expérimentateur de choisir son niveau de risque.

La standardisation

La méthode de standardisation "MIAME" ("Minimum information about a microarray experiment") est une charte qui décrit l'information minimale (à propos d'une expérience de puce à ADN) requise pour que les résultats de cette expérience soient interprétables, d'une manière non-ambigüe et de sorte que cette expérience soit reproductible.

Tout expérimentateur qui désire déposer ces données issues de puces à ADN dans une banque doit répondre à cette charte en indiquant (entre autre) :

• le but et une brève description de l'expérience
• le ou les facteur(s) expérimental(aux) étudié(s)
• l'origine et les caractéristiques des échantillons biologiques
• les protocoles d'extractions des ARN, d'hybridation
• les méthodes d'acquisition des données brutes de la puce, de normalisation de ces données (logiciels et matériels)
• les caractéristiques de la puce (verre, plastique, ...)
• une présentation sous forme de tableau des résultats (numéro d'accession des gènes identifiés, description des produits de ces gènes, bruit de fond et mesure de l'intensité de fluorescence, rapport d'intensité, ...)

c. Analyse des données : la prédiction

Outre l'obtention de listes de gènes différentiellement transcrits, on peut suivre le profil de transcription d'un gène : l'ensemble des valeurs de transcription mesurées dans des conditions diverses ou au cours d'une étude cinétique.

Dans ce cas, l'une des 2 sources d'ARN hybridés est fixée de sorte que toutes les valeurs de log₂(r) soient comparables. Cette source est alors considérée comme la référence.

On peut dés lors s'intéresser :

• au développement de méthodes de prédiction de phénotype(s) différent(s) et connu(s) en terme de profils d'expression de certains gènes (apprentissage supervisé).

• à l'identification puis le regroupement ("clusterisation") de phénotype(s) inconnu(s) à partir de profils d'expression (apprentissage non supervisé). L'intéret est de générer des hypothèses sur des gènes regroupés dans un "cluster": un gène, dont la fonction est inconnue, qui se retrouve avec un grand nombre d'autres gènes impliqués dans une fonction cellulaire particulière, a une forte probabilité d'être lui-aussi impliqué dans cette fonction.

Exemples de logiciels de regroupement : "J-Express" - "MultiExperiment Viewer" - "Genesis"

Figures ci-dessous : une série de profils d'expression de gènes désordonnés (figure de gauche) peut être convertie en une série de groupes par le regroupement hiérachique (Eisen et al., 1998).

Le résultat (à droite) est un arbre qui montre l'évolution de l'expression dans le temps pour certains gènes hypothétiques.

• Les gènes de la classe "down" se regroupent.
• Il est probable que les gènes "unknown14", "unknown10" et "unknown13" de la classe "unknown" aient des fonctions similaires à ceux de la classe "down".
• Il en va de même pour les classes "yoyo", "mid" et "late" en ce qui concerne les autres gènes de la classe "unknown".

Source : "Précis de génomique" (2004) - G. Gibson & S. Muse

Figure ci-dessous : différence de profils d'expression des gènes mitochondriaux de la famille des transporteurs de Arabidopsis thaliana. Les résultats mettent en évidence les variations selon type de tissus et la réponse à des stress hormonaux et environnementaux.

Source : Millar & Heazlewood (2003) "Genomic and Proteomic Analysis of Mitochondrial Carrier Proteins in Arabidopsis" Plant Physiol. 131, 443 - 453

4. L'interprétation biologique des données : l'ontologie et l'annotation

L'interprétation biologiques des données issues des puces à ADN (et d'autres technologies) nécessite de corréler les résultats de ces données à des informations encyclopédiques contenues dans certaines bases de données.

Source : CBB group (Berlin)

a. L'ontologie

Une ontologie est un ensemble structuré de termes et de concepts qui représentent le sens d'un champ d'informations, que ce soit par :

• les métadonnées (données qui définissent une autre donnée) d'un espace de noms (ensembles de termes appartenant à un même répertoire)
• les éléments d'un domaine de connaissances

Chaque terme de l'ontologie est associé à des "lexicons" (synonymes, homonymes, hyperonymes, ...). Le réseau autour d'un terme est appelé concept.

Les concepts sont formalisés sous forme d'un graphe au sein duquel il existe des relations sémantiques ou d'inclusion ("appartient à").

b. Le consortium Gene Ontology

De manière schématique, on peut considérer qu'en génomique, l'ontologie est associée aux notions de terminologie et de classification.

Le consortium Gene Ontology (GO) :

• augmente la communicabilité entre bases de données
• distribue une classification qui est l'une des références en génomique fonctionnelle
• définit un vocabulaire contrôlé (l'ontologie)
• unifie ainsi la multiplicité des termes employés pour décrire un concept

Le produit d'un gène :

• est adressé à un ou plusieurs compartiments cellulaires ("Cellular Component" - CC)
• participe à un ou plusieurs processus biologiques ("Biological Process" - BP)
• il y remplit une ou plusieurs fonctions moléculaires ("Molecular Function" - MF)

GO décrit donc les produits des gènes via un ensemble de termes au sein d'un graphe dirigé acyclique ("Directed Acyclic Graph" - DAG) qui contient 3 axes hiérarchiquement indépendants (CC, BP et MF).

Les termes de GO (les noeuds de l'ontologie) sont liés par un ensemble de relations.

En particulier : "Is a", "Part of", "Regulates", "Positively Regulates" et "Negatively Regulates".

Chaque terme hérite de la signification de tous les termes qui le séparent de la racine de l'ontologie (notion d'ancêtre, parent et enfant).

Le niveau de preuve d'une annotation est précisée par des codes ("Evidence Codes") répartis en catégories : "Experimental", "Computational analysis", "Author statement" (déclaration d'auteur), "Curatorial statement" (déclaration de curateur), "Automatically-assigned".

La dernière catégorie est "Automatically-assigned" (annotation automatique) dont le sous-code "Inferred from Electronic Annotation" (IEA) représente environ 95% de l'annotation.

Voir "Evidence Code Decision Tree".

Enfin, on ne soulignera jamais assez le le rôle primordial des scientifiques que l'on nomme curateurs. Ils effectuent, grâce à leur immense culture, un travail dans l'ombre qui assure la qualité, la rigueur et la pertinence des informations associées aux données de génomique, transcriptomique, protéomique et autres contenues dans les bases de données.

GO est extrêmement complexe et nécessite un "navigateur" dans l'arbre de l'ontologie. Le plus utilisé pour GO est AmiGO2.

c. Exemples de logiciels et d'interfaces web pour l'annotation

1. Le consortium GO propose un ensemble de logiciels ("Gene Ontology Tools") pour traiter et analyser des données de divers types, en particulier celles issues des puces à ADN. Ces logiciels sont utilisables directement via une interface Web ou à installer sur l'ordinateur pour divers types de systèmes d'exploitation (Unix, Linux, Windows, Mac)

2. L'une des interfaces les plus didactiques et intuitives pour l'annotation : "QuickGO (GO Browser)".

3. Autre exemple de logiciel - interface web : "GOrilla". Un exemple trés didactique de classification hiérarchique et d'ontologie est montré avec le lien "Running example".

4. Voir un cours sur l'annotation.

d. Exemples de bases de données de niveau de transcription de gènes

• Gene Expression Omnibus (GEO) : base de données d'expression et d'abondance de molécules (ARNm, ADN génomique et protéines) et aussi un système de recherche de ces données d'expression. Les données soumises répondent à la charte de standardisation "MIAME" et à un cahier des charges trés strict. Les données de GEO sont issues de diverses technologies : puces à ADN, méthode SAGE et spectromètrie de masse.

• La base de données ArrayExpress / EBI.

e. La collection de bases de données KEGG

Il propose pour les voies métaboliques et les métabolites impliqués dans ces voies, des graphes d'interaction entre les enzymes impliquées dans ces voies et, par extension, entre les gènes qui codent ces enzymes.

Source : KEGG

C'est un outil puissant pour la métabolomique.

Exemple : la biotine existe sous forme libre ou sous forme de groupement prosthétique lié à certaines carboxylases qui catalysent des réactions de synthèse des acides gras ou de certains acides aminés.

En allant sur le site, l'image originale est interactive.

En cliquant sur les N° EC ou les noms, on accéde à une multitude d'informations sur les molécules choisies.

5. "Chromatin ImmunoPrecipitation on Chip"

Cette méthode appelée aussi "ChIP on chip" permet d'identifier les protéines qui se fixent à l'ADN. Elle est extrêmement utile pour l'étude des sites de fixation des facteurs de transcription, ou les histones (étude des profils épigénétiques), par exemple.

Figure ci-contre : Techniques de traitement des acides nucléiques avant séquençage pour l'analyse de parties spécifiques des génomes.

Source : ENCODE

Par exemple :

• l'hétérochromatine : les régions riches en nucléosomes (complexe ADN - histones)
• l'euchromatine : les régions pauves en nucléosomes

La méthode "ChIP on chip" combine celle de l'immunoprécipitation de la chromatine et celle des puces à ADN.

On crée d'abord une liaison covalente in vivo entre les protéines et la partie de l'ADN avec lesquelles elles interagissent. On utilise la formaldéhyde en général.

Source : Wikipédia

L'ADN de la cellule est extrait puis découpé en courts fragments. On sélectionne les fragments d'ADN qui sont associés à la protéine étudiée avec un anticorps spécifique de cette protéine.

Les complexes [ADN-protéine-anticorps] sont précipités. Cette précipitation élimine l'ADN qui ne s'est pas associé à la protéine étudiée.

La partie protéique du complexe [ADN-protéine-anticorps] est protéolysé afin de ne conserver que l'ADN.

En conséquence, les courts fragments d'ADN récupérés sont ceux qui interagissent avec la protéine étudiée. Ces fragments sont identifiés par la technique des puces à ADN.

*Le "chromosome interactome" : le super-enroulement et compacité de l'ADN dans les chromosomes (chromatine, histone) : une fois déplié, la molécule d'ADN d'une cellule de l'homme mesure environ 2 m, soit 200.000 fois le diamètre moyen du noyau d'une cellule de mammifère.

Source : de Wit & de Laat (2012)

L'exploration du "chromosome interactome" et des interactions chromatine-chromatine à longue distance in vivo est liée au développement de nouvelles technologies incluant le séquençage à très haut débit :

• "Chromosome Conformation Capture" (3C)
• "Circularized Chromosome Conformation Capture" ou "Chromosome conformation capture-on-chip" (4C)
• "Carbon-Copy Chromosome Conformation Capture" (5C)
• ChIA-PET
• Hi-C

6. Comparaison des puces à ADN et de la technique de séquençage "RNA-seq"

Voir un développement concernant la technologie RNA-seq.

a. Les puces à ADN et la technique RNA-seq ont toutes deux une haute reproductibilité de résultats avec des réplicats biologiques.

b. Les puces à ADN permettent difficilement de distinguer le cas "pas de transcription" du cas "très faible transcription".

c. En raison de la différence de transcription des gènes et/ou du nombre de gènes codant un même type d'ARN messagers, il n'existe dans une cellule que quelques copies de certains ARN messagers et des dizaines de milliers de copies d'autres ARN messagers :

• La sensibilité de détection des ARN messagers rares est donc un paramètre capital.
• La sensibilité de détection de la technique RNA-seq dépend de la profondeur du séquençage et celle des puces à ADN est quasiment constante. Celà signifie qu'en théorie, si on atteind une profondeur de séquençage suffisante, la technique RNA-seq permet de déterminer le nombre réels de toutes les molécules d'ARN dans un échantillon.

d. De multiples transcrits sont générés à partir de certains gènes par épissage alternatif. L'un des avantages de la technique RNA-Seq est sa capacité à détecter ces isoformes différentiellement transcrites :

• en effet, sur une puce à ADN, une sonde courte donnée cible soit un exon constitutif (présent dans tous les transcrits issus de l'épissage alternatif), soit un exon spécifique de l'un des transcrits. Dans le second cas, ce transcrit est détecté mais les autres transcrits issus du même gène sont ignorés.
• en conséquence, les ensembles de sondes de puces à ADN ne peuvent pas représenter tous les transcrits de tous les gènes.

e. Les puces à ADN sont sujettes à une saturation d'hybridation en ce qui concerne les transcrits très abondants. Elles ne peuvent pas fournir des mesures quantitatives fiables des changements subtils de la transcription de gènes abondants.

f. La technique RNA-Seq permet d'identifier des variants d'un seul nucléotide ("single nucleotide polymorphism" - SNP). La technique RNA-Seq présente deux avantages dans la détection de variants génétiques :

• aucune connaissance préalable concernant des variants potentiels n'est requise
• la détection est faite sur l'ensemble du génome même pour les rares SNP

g. La technique RNA-Seq permet :

• de détecter une transcription allèle-spécifique
• d'identifier les différences ARN-ADN et ainsi d'étudier l'édition des ARN (exemples : A => I et C => U)
• d'identifier significativement plus de gènes

Pour l'instant la technique RNA-seq présente deux inconvénients :

• elle a un côut plus élevé par échantillon
• elle nécessite un temps très long d'analyse des données (et donc des moyens de calculs énormes)

Par ailleurs, l'un des atouts actuels (mais qui ne peut que diminuer avec le temps) des puces à ADN est l'acquis des dizaines de milliers d'expériences qui ont été menées avec cette technique et les différentes annotations des transcriptomes issues de toutes ces expériences.

L'un des atouts de la technique RNA-seq (ou d'une autre technologie à venir) est l'évolution très rapide des technologies de séquençage à très haut débit : le développement des méthodes avec multiplexage par répartition codes barres, des lectures ("reads") plus longues et un plus grand nombre de lectures appariées ("paired end reads").

Pour l'instant les puces à ADN et la technique RNA-seq restent donc complémentaires et peuvent même être combinées avec des résultats très importants.