1. Rappel des buts de la génomique et de la protéomique

2. L'annotation : présentation générale

3. L'annotation des gènes avec l'ontologie

4. Les problèmes de l'annotation

5. Les moyens pour l'annotation

6. Quelques méthodes et outils pour l'annotation

7. Liens Internet et références bibliographiques

1. Rappel des buts de la génomique, de la transcriptomique et de la protéomique

La génomique structurale analyse la structure des gènes et autres parties du génome. La génomique fonctionnelle analyse la fonction des gènes et autres parties du génome. Elle inclue l'analyse du transcriptome (ARN messagers) ou transcriptomique.

Ces disciplines permettent l'annotation des génomes et l'identification des séquences informatives (les gènes avec ou sans introns codant des protéines ou des ARN, les séquences régulatrices, les séquences répétées, les éléments transposables, ...).

La protéomique a pour but d'identifier (et de quantifier) l'ensemble des protéines synthétisées ou protéome, à un moment donné et dans des conditions données au sein d'un tissu, d'une cellule ou d'un compartiment cellulaire.

Le protéome est extrêmemement complexe à plusieurs titres :

• épissage alternatif des transcrits primaires
• modifications post-traductionnelles et autres maturations des protéines
• stade de développement ou phase d'activité cellulaire
• dynamique du taux de synthèse et temps de demie-vie des protéines
• ...

La protéomique apporte des réponses auxquelles la transcriptomique ne peut répondre :

• compléments d'informations sur les modalités d'expression des gènes pour les organismes dont le génome n'a pas encore été séquencé ou pour lesquels les programmes de prédiction de séquences codantes sont moins fiables. Un exemple est l'aide au repérage des bordures d'exons ce qui permet en retour une meilleure annotation du transcriptome et donc des génomes.
• estimation quantitative des concentrations des protéines synthétisées (méthode de marqueurs d'affinité contenant un isotope d'identification : ICAT).
• obtention de données sur la fonction des protéines et les interactions entre protéines ou entre protéines et autres molécules biologiques (approche double-hybride ou approche "tandem affinity purification by tag" - TAP/TAG).

Les buts de ces disciplines sont donc (liste non exhaustive) :

• décrire l'organisation des gènes et localiser les motifs de régulation de l'expression des gènes (sites d'initiation ou de terminaison de la transcription, ...)
• déterminer la structure globale des gènes : rechercher les cadres de lecture ouvert ou ORF ("Open Reading Frame"), localiser les régions codantes, localiser les sites d'épissage aux bornes exon / intron, ...
• identifier les régions des génomes dont on ignore encore le rôle et élucider ce rôle, déterminer les pseudogènes, les éléments transposables ...
• étudier les différences d'expression des produits des gènes dans le temps et pour chaque type de tissus et de cellules
• étudier la structure et la fonction des protéines et des ARN pour lesquelles les gènes codent
• étudier le profil de méthylation
• étudier les interactions ADN / protéines (facteurs de transcription, ...)
• intégrer toutes ces informations dans un ensemble plus vaste, celui de l'ensemble des voies métaboliques (métabolome)
• décrire les interactions entre tous ces types de macromolécules biologiques (interactome)
• obtenir ces données pour le plus grand nombre d'organismes possibles ("GOLD : Genomes OnLine Database").
• la génomique médicale
• la métagénomique : étude du génome d'un organisme prélevé directement dans un environnement complexe (intestin, océan, sols, ...), à l'inverse d'un organisme de laboratoire. Le but est d'obtenir des informations sur l'incidence de cet environnement. Le préfixe "méta" signifie "après, au-delà de, avec, ...". "Metagenomics at EBI".
• l'épigénétique et l'épigénomique : étude de l'influence de l'environnement et de l'histoire individuelle sur les modifications de l'expression des gènes d'une génération à l'autre. Le préfixe "épi" signifie "sur, au-dessus, ...".
• ...

2. L'annotation : présentation générale

L’annotation d’un génome, d'un transcriptome d'un protéome, d'un métabolome ... consiste à documenter de la manière la plus exhaustive les informations issues de ces disciplines.

On conçoit que c'est un travail encyclopédique de titan, d'autant que de nouvelles données s'accumulent qui doivent être croisées. L'adéquation entre fouille de données textuelles ("text mining") automatique pertinente et recherche "manuelle" par les experts fait l'objet de "workshops" internationaux ("BioCreative Article Classification Task" - BBCIII-ACT) et de nombreuses publications.

a. L’annotation automatique s'appuie (essentiellement) sur des comparaisons des séquences à annoter avec les séquences présentes dans les banques de données.

Les algorithmes recherchent des similarités / homologies de séquence, de structure, de motifs, … Ils permettent de prédire la fonction d’une molécule et de transfèrer automatiquement l'annotation entre les molécules homologues.

Si l'annotation des molécules de référence est correcte, il n'y a pas de souci. Si elle est fausse, c'est un "jeu de domino" : l'erreur initiale est répercutée de proche en proche.

b. L’annotation manuelle (ou curation) par des experts (des curateurs) qui valident ou invalident la prédiction en fonction de leurs connaissances ou de résultats expérimentaux.

L'annotation manuelle est donc tout à fait indispensable. Mais, vue la quantité "astronomique" de données acquises quotidiennement, il est illusoire d'envisager une curation manuelle de l'ensemble des données en temps réel.

On mesure aisément le problème : une quantité "minime" de données traitées par l'homme en temps réel qui induit un retard / décalage de plus en plus grand.

c. L’annotation structurale dans le cas d'un génome tente de prédire :

• le contenu en gènes et leur localisation dans le génome en recherchant les phases de lecture ouverte dans les 6 cadres de lecture (ORF - "Open Reading Frame"), les introns et les exons.
• l'organisation des gènes (régions non codantes - voir ci-dessus, gènes, opérons, séquences promotrices, terminateurs, sites de fixation aux ribosomes, ...).

Il existe des méthodes intrinsèques ou ab-initio qui s'appuient sur techniques informatiques d'apprentissage automatique utilisant :

• des modèles de Markov interpolés (exemples de logiciels : "Glimmer 1.0", "EasyGene", "GeneMark", ...)
• des modèles de contexte interpolés (exemples de logiciels : "Glimmer 2.0", "Glimmer 3.0", ...)

Il existe des méthodes extrinsèques qui reposent sur la comparaison des ORF avec les séquences présentes dans les banques de données (exemples : "Orpheus", "Critica", "Reganor", ...).

d. L’annotation fonctionnelle tente de prédire la fonction potentielle des gènes (notion d'étiquette, avec nom, fonction et interactions probables).

e. L’annotation relationnelle tente de décrire les relations (interactions) entre les produits des gènes (familles de gènes, réseaux de régulation, réseaux métaboliques, ...).

3. L'annotation des gènes avec l'ontologie

a. L'ontologie et le consortium Gene Ontology

Une ontologie est un ensemble structuré de termes et de concepts qui représentent le sens d'un champ d'informations, que ce soit par :

• les métadonnées (données qui définissent une autre donnée) d'un espace de noms (ensembles de termes appartenant à un même répertoire). Voir un exemple de "méta-données" ("data") selon l'ontologie de EDAM ("EMBRACE Data and Methods").
• les éléments d'un domaine de connaissances.

Chaque mot-clé de l'ontologie est associé à des lexicons (synonymes, homonymes, hyperonymes, ...). Le réseau autour d'un mot-clé est appelé concept.

Les concepts sont formalisés sous forme d'un graphe au sein duquel il existe des relations sémantiques ou d'inclusion ("appartient à").

De manière schématique, on peut considérer qu'en génomique, l'ontologie est associée aux notions de terminologies et de classifications.

Le consortium Gene Ontology (GO) :

• distribue une classification qui est l'une des références en génomique.
• définit un vocabulaire contrôlé (l'ontologie) et unifie ainsi la multiplicité des termes employés pour décrire un concept.
• augmente la "communicabilité" entre bases de données.

b. Les termes GO

Le produit d'un gène :

• est adressé à un ou plusieurs compartiments cellulaires : "Cellular Component" (CC) / plus de 3000 termes
• participe à un ou plusieurs processus biologiques : "Biological Process" (BP) / plus de 20 000 termes
• il y remplit une ou plusieurs fonctions moléculaires : "Molecular Function" (MF) / plus de 9000 termes

Les termes GO sont les noeuds de l'ontologie. Il en existe actuellement plus de 32000 dans GO.

GO décrit donc les produits des gènes via un ensemble de termes d'un graphe dirigé acyclique ("Directed Acyclic Graph" - DAG) qui contient 3 axes hiérarchiquement indépendants (CC, BP et MF, définis ci-dessus).

Source : GO

Un terme GO est défini par  :

• un nom de terme : dans l'exemple ci-dessous "glycolysis"
• un N° d'accession unique (préfixe "GO") : "0006096"
• une "ontologie" : "Biological Process"
• une définition dont les sources sont mentionnées
• des commentaires sur la signification ou l'utilisation du terme
• le cas échéant : des synonymes qui ont un lien avec le nom du terme ("related") ou qui sont exactement équivalents("exact") ou qui ont une acception plus large ou plus restrictive ("broad")
• le cas échéant : des références croisées avec d'autres bases de données ("xref")

Les termes GO sont liés par un ensemble de relations : "Is a" - "Part of" - "Regulates" - "Positively Regulates" - "Negatively Regulates" - "Occurs in"

Voir un développement sur les relations de l'ontologie de GO.

Chaque terme hérite de la signification de tous les termes qui le séparent de la racine de l'ontologie (notion d'ancêtre, parent et enfant). Ces termes sont donc placés dans une hiérarchie rigoureuse qui établit entre eux des liens univoques de "parents à enfants".

Figure ci-dessous : illustration des liens entre les termes pour le mot "chloroplast" lui-même inclu dans le concept "cellular component".

Source : Annotation de la base de données "QuickGO"

c. Les niveaux de preuve d'une annotation

Ils sont précisés par des codes ("Evidence Codes") répartis en catégories : "Experimental" - "Computational" - "Author statement" (déclaration d'auteur) - "Curator statement" (déclaration de curateur)

Source : GO

La dernière catégorie est "Automatically-assigned" (annotation automatique) dont le sous-code "Inferred from Electronic Annotation" (IEA) représente actuellement près de 95% de l'annotation. Voir : Skunca et al. (2012)

On ne soulignera jamais assez le le rôle primordial des scientifiques que l'on nomme curateurs. Ils effectuent, grâce à leur immense culture, un travail dans l'ombre qui assure la qualité, la rigueur et la pertinence des informations associées aux données de génomique, transcriptomique, protéomique et autres contenues dans les bases de données.

GO est extrêmement complexe et nécessite un "navigateur" dans l'arbre de l'ontologie. Le plus utilisé pour GO est AmiGO.

Voir un exemple de procédure d'annotation basée sur la séquence.

4. Les problémes de l'annotation

a. Le décalage entre le nombre de génomes séquencés et leur documentation encyclopédique

Le séquençage à trés haut débit génère des quantités phénoménales d'information.

On peut donc considérer que l'annotation est maintenant le point d'achoppement des disciplines en "omique".

En regard de la performance extraordinaire des technologies de ces domaines (séquençage d'un génome par jour) et donc l'accumulation tout à fait colossale de données de tous types dans les banques de données, on ne peut qu'induire un décalage entre les données brutes et leur interprétation, donc leurs significations biologiques.

Tant que ce décalage existera, le pas suivant qui est d'extraire une "sur-information biologique" de cette information brute, ne pourra être correctement franchi.

Source : Hanson et al. (2010)

b. Les erreurs ou l'absence d'annotation

Les "inconnues" dans les bases de données :

• Le séquençage en masse de centaines de génomes bactériens a révélé que 30% à 40% des protéines n'ont pas de fonction biologique élucidée.
• Sur la base de 1000 génomes on estime le nombre de protéines annotées "inconnues" à ... 10⁶ !
• A titre de rappel : "GOLD" en contient près de 56.000 dont plus de 6600 complètement séquencés.
• Pour certaines familles de gènes, on estime à 60% le taux d'erreur d'annotation.
• Plus le nombre de génomes séquencés augmente, plus on découvre des familles de protéines qui ne sont pas documentées.
• Pour 36% des 3736 enzymes qui ont un numéro EC, il n'existe pas de séquences de gènes ou de protéines qui leur soient homologues.

Source : Hanson et al. (2010)

Il est dommage d'accumuler une quantité inouie de données si on ne peut pas en tirer toute l'information. Ce déluge de données peut même "noyer" l'information 'actuelle" pertinente et nuire (au moins dans un premier temps).

Quel intérêt d'obtenir à la suite d'une étude longue et coûteuse via des EST ou des puces à ADN, des informations telles que : "not annotated", "hypothetical protein" (!), "unnamed molecule, "putative function", ...

On aboutit aux mêmes conclusions : X gènes sont sur-exprimés et Y sont sous-exprimés. Mais qui sont-ils, que font-ils, où sont adressées les protéines pour lesquelles ils codent ... ?!

5. Les moyens pour l'annotation

a. Exemples de logiciels et d'interfaces web pour l'annotation

1. Le consortium GO propose un ensemble de logiciels ("Gene Ontology Tools") pour traiter et analyser des données de divers types, en particulier celles issues des puces à ADN. Ces logiciels sont utilisables directement via une interface Web ou à installer sur l'ordinateur pour divers types de systèmes d'exploitation (Unix, Linux, Windows, Mac)

2. L'une des interfaces les plus didactiques et intuitives pour l'annotation : "QuickGO (GO Browser)" et "Gene Ontology Annotation (GOA)" (en particulier le lien : "Search GOA").

3. Autres exemples de logiciels - interface web :

• "GOrilla". Un exemple trés didactique de classification hiérarchique et d'ontologie est montré avec le lien "Running example".
• "Ontologizer".

4. DAVID : outil pour annoter les données de transcriptome.

5. TD en ligne "Ontologies en biologie" - M2 Génomique Fonctionnelle - Université Aix - Marseille II

b. Exemple dans le cas d'un gène

Une fois un gène identifié, il faut obtenir le plus d'informations concernant :

• la structure du gène et des séquences de régulation, la position des introns / exons, les différents transcrits possibles (épissage alternatif)
• la ou les fonction(s) biologique(s) / biochimique(s) des molécules pour lesquelles il code
• leur(s) localisation(s) sub-cellulaire(s)
• l'expression spatio - temporelle de ces molécules
• leurs liens avec les données de génétique concernant leurs fonctions et les variations phénotypiques des mutants pour le(s) produit(s) que code ce gène codée(s).
• leur implication dans des processus de régulation
• leur interactions avec d'autres molécules biologiques
• ...

Des logiciels bioinformatiques sont dédiées à l'étude de la structure des gènes et à leur annotation. Par exemple :

• BLAST qui permet d'aligner la séquence du génome avec les séquences d'ADNc ou rechercher des similarités entre ce génome et d'autres génomes déjà connus et annotés.
• "ORF Finder" (NCBI) : recherche de cadres de lecture ouvert ou ORF ("Open Reading Frame")
• Suite logicielle pour l'annotation de Arabidopsis thaliana

Des bases de données regroupent les données de structure des gènes et leur annotation :

• Gene Ontology Annotation (GOA) Database
• Rice Genome Annotation Project
• Vertebrate Genome Annotation (VEGA) database
• Ensembl Genome browser

Bien sur, l'ensemble de ces données sont intégrées dans les grandes bases de données biologiques mondiales que sont :

• NCBI / Entrez (National Center for Biotechnology Information)
• EMBL - EBI
• UniProt

c. Les langages informatiques / Web

L'annotation va de paire avec l'utilisation de langages spécifiques pour standardiser le format des données afin qu'ils soient transmis sans difficulté d'un service (logiciel) bioinformatique à un autre.

De plus en plus, le langage XML avec des schémas de format XSD s'imposent.

Figure ci-dessous : démarche logique du flux ("workflow") de données (ovales rouges) via un ensemble de services (logiciels) bioinformatiques (rectangles bleus). La transformation d'un type de données en un autre est d'autant plus performante que les formats en entrée et en sortie sont standardisés afin que n'importe quel logiciel puissent "accepter" les données entrantes (format d'échange commun BioXSD).

Source : Pettifer et al. (2010)

d. Les autres moyens pour l'annotation

L'ensemble de ces moyens fait partie de la génomique comparative et s'appuie sur la notion d'association.

L'exemple typique est celui de génes bactériens regroupés en opéron codant les différentes enzymes qui catalysent les étapes d'une voie métabolique : la fonction d'un géne inconnu peut-être inferrée à partir des génes connus de cet opéron.

Cette notion est étendue à la comparaison de génomes entiers.

Une étude récente a ainsi permis de prédire la fonction de 19 familles de protéines d'Arabidopsis et de procaryotes (Gerdes et al., 2011).

Parmi ces moyens, on peut citer :

• les ensembles de gènes proches physiquement dans le génome ("gene clustering"). Exemples : bases de données "STRING", "SEED", ...
• les profils de co-occurence phylogénétique selon l'hypothèse que les enzymes d'une même voie métabolique seront ou toutes présentes ou toutes absentes au sein d'un organisme donné. Exemples : outils ou bases de données "STRING", "PHYDBAC", "MBGD", "Phylogenetic Profiler" ...
• la fusion de gènes qui permet d'obtenir des données sur l'interaction entre les protéines issues de ces génes. Exemples : "FusionDB"
• les sites de régulation de l'expression de génes communs à plusieurs gènes ("SwissRegulon")
• la reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome
• les profils d'expressions de gènes (transcriptomique)
• les données qualitatives et quantitatives concernant les protéines (protéomique)
• les associations issues de comparaison de phénotypes
• la comparaison des structures secondaires ("PSIPRED", "GenTHREADER"), voire tridimensionnelles des protéines et de certains ARN.

D'autres sources d'informations (textuelles, images 2D, ...) peuvent être utilisées et combinées, soit manuellement, soit automatiquement. C'est le cas, par exemple, des méthodes d'annotation des gènes de l'embryon de souris (méthodes et base de données "EMAGE").

6. Quelques méthodes et outils pour l'annotation

a. Généralités

Elles sont de diverses natures, mais pour la plupart extrêmement théoriques. On conçoit intuitivement qu'il faut obtenir des outils logiciels qui puissent :

• de manière automatique et bien sûr avec la plus grande fiabilité possible
• effectuer une fouille la plus exhaustive de millions (milliards ?) de données
• données de "natures" (littéral, sémantique, syntaxique, numériques, hypertexte, images, ...) et de formats différents
• en effectuer une synthèse avec le maximum de rigueur et de précision
• proposer une réponse / solution / interprétation à l'utilisateur avec le minimum d'ambiguité
• le tout rapidement

Source : "Ontologizer"

Les avancées en bioinformatique (théoriques et/ou logicielles) permettent de plus en plus d'atteindre ce but.

Dans l'exemple décrit ci-dessous, les auteurs décrivent une méthode de recherche de "catégories biologiques" contenant le plus d'informations liées aux gènes mis en évidence par telle ou telle approche de génomique et/ou de transcriptomique.

Remarque : les auteurs emploient l'expression "biological categories". Que signifie-t-elle du point de vue de l'ontologie et encore plus de celui de la biologie ?

Selon eux, le problème est que des bases de données telle que "Gene ontology" (GO) contiennent des milliers de "catégories" qui se chevauchent : l'obtention d'une "bonne catégorie" en renvoie un grand nombre d'autres qui y sont corrélées, ce qui n'aide pas à la prise de décision.

Leur modèle (ci-dessous) analyse toutes les "catégories" d'une base de données d'ontologie en les insérant dans un réseau Bayesien ("model-based gene set analysis" - MGSA).

Source : Bauer et al. (2010)

Au sein de ce réseau, la réponse de tel ou tel gène ("gene response" = sur-expression ou sous-expression ? Voir l'article) est modèlisée en fonction de "l'activation" de "catégories biologiques" identifiées par inférence probabilistique.

Leur résultat consiste à renvoyer la "meilleure catégorie" (augmentation de la précision) avec le moins de "catégories corrélées" (diminution du bruit de fond).

Figure ci-dessous : l'algorithme qui traduit l'approche et le modèle décrits ci-dessus.

Source : Bauer et al. (2010)

Voir l'application qui a été développée par ce groupe : "Graphviz".

b. Des outils d'annotation via les motifs

Les motifs sont des séquences consensus d'acides aminés qui signe une famille de protéines. Voir l'exemple du serveur Web "GOmotif" : entrer la séquence [GS]SSE.[DEG] (format "Prosite").

c. Des outils de ré-annotation

D'autres outils bioinformatiques permettent de ré-annoter l'existant ou de confirmer l'annotation existante et ainsi de corriger les erreurs ou de donner des pistes pour une correction ultérieure. La figure ci-dessous présente le protocole d'analyse des erreurs d'annotation des fonctions des super familles d'enzymes dans les bases de données publiques.

Source : Schnoes et al. (2009)

d. Des outils et des bases de données pour l'analyse des réseaux d'interactions proteines - protéines

"PPI Finder" : un outil web pour la fouille de données textuelles des résumés publiés dans "PubMed" (NCBI) à la recherche de co-occurrences de mots et d'interactions entre ces mots, validées par leur existence dans les bases de données d'interactions protéines - protéines ("PPI databases") dont HPRD et BioGRID et les mots partagés de l'ontologie.

e. D'autres outils en ligne

• "g:Profiler"
• "GraphWeb"
• "ProteinOn"
• "ToppGene Suite"