1. Introduction

a. Condensation de la chromatine - euchromatine et hétérochromatine
b. Epigénétique et profils épigénétiques

2. Les histones et leur association dans les nucléosomes

3. Modifications post-traductionnelles des histones

4. Signatures de la chromatine au niveau des gènes transcrits

5. Les protéines "writers"

a. Les histone lysine acétyltransférases (HAT)
b. Les histone lysine méthyltransférases (HKMT)
c. Les histone arginine méthyltransférases (PRMT)

6. Les protéines "erasers"

a. Les histone lysine désacétylases (HDAC)
b. Les histone lysine déméthylases (HLD)
c. Les histone arginine déméthylases (HRDM)

7. Domaines protéiques d'interaction avec les histones modifiées

8. La méthylation - déméthylation de l'ADN

a. Formation de la 5-méthyl-cytosine (5mC)
b. Les ADN méthyltransférases
c. Les ilots CpG

9. Régulation par les ARN non codants

a. La méthylation de novo de l'ADN dirigée par les siARN chez les plantes
b. Régulation épigénétique par les longs ARN non-codants ("Long noncoding RNA")
c. Rôle possible des boucles R dans la terminaison de la transcription

10 Méthodes pour étudier les modifications épigénétiques

11. Quelques abréviations et noms de protéines impliquées dans l'épigénétique

12. L'épitranscriptome : N6-méthyl-adénosine et autres nucléosides modifiés

13. Liens Internet et références bibliographiques

1. Introduction

L'ADN du génome haploïde de l'homme contient environ 3 milliards de paires de base. Chaque cellule diploïde (23 paires de chromosomes) de l'homme contient donc environ 6 milliards de paires de base.

• Si l'on considère qu'une paire de base a une longeur moyenne de 0.34 nm, chaque cellule diploïde contient environ 2 mètres d'ADN [(0.34 10^-9) × (6 10⁹)].
• On estime que le corps humain contient environ 50.000 milliards de cellules, soit une longueur totale d'ADN d'environ 100.000 milliards de mètres.
• Par ailleurs, la distance soleil - terre est d'environ 150 milliards de mètres.

En conséquence, l'ensemble des cellules du corps humain contient une longueur d'ADN qui correspond à 670 fois la distance soleil - terre ou 2,5 millions de fois le tour de la terre.

Dans le noyau, l'ADN est donc extrêmement compacté, condensé et les gènes sont empaquetés dans la chromatine.

Source : Kireev et al. (2008)

Les processus dynamiques de remodelage (condensation - décondensation / changement de structure) de la chromatine sont nécessaires pour l'étape initiale de la transcription des gènes.

En effet, ce remodelage module l'accessibilité des protéines qui régulent et contrôlent la transcription aux promoteurs et aux régions régulatrices de la transcription ("enhancer", "silencer", "insulator", ...).

a. Condensation de la chromatine - euchromatine et hétérochromatine

L'ADN chromosomique est empaqueté à l'intérieur du noyau à l'aide des nucléosomes qui sont des complexes [ADN chargé négativement - protéines histone chargées positivement].

Source : Annunziato, Nature (2008)

Un nucléosome est composé de huit protéines histone autour desquelles l'ADN (environ 146 - 147 paires de base) s'enroule 1,66 fois. C'est l'euchromatine (structure en collier de perles ou "beads on a string").

Les nucléosomes se replient pour former une fibre d'hétérochromatine de 30 nanomètres qui forme elle-même des boucles de longueur moyenne 300 nanomètres.

Les boucles sont à leur tour compressées et repliées pour former une fibre de 250 nm d'épaisseur.

Celle-ci est étroitement enroulée pour former les chromatides d'un chromosome.

Les différences entre euchromatine et hétérochromatine sont beaucoup plus importantes que celà, tant du point de vue structural que fonctionnel.

En particulier :

• euchromatine : elle est est peu ou pas méthylée, "riche en gènes" et sa structure moins condensée permet les mécanismes de la transcription (fixation de l'ARN polymérase et des protéines de régulation).
• hétérochromatine : la mono-méthylation de la lysine 9 de l'histone H3 (H3K9me), les tri-méthylations répressives H3K9me3 et H3K27me3 et le recrutement de la protèine HP1 sont des étapes essentielles de la formation de l'hétérochromatine. Sa structure est condensée et "inactive" du point de vue de la transcription.
  1. hétérochromatine facultative : régions condensées, silencieuses du point de vue transcriptionnel de la chromatine qui peuvent passer de manière réversible dans un état décondensé permettant la transcription.
  2. l'hétérochromatine constitutive : gènes silencieux en permanence dans des régions du génome telles que les centromères et les télomères.

Source : Gaspar-Maia et al. (2011)

• Les histone-lysine N-méthyltransférases (qui méthylent K4, K9 et K27) incluent G9a (aussi appelée EHMT2), SUV39H1, SUV39H2 et SETDB1 : elles ont un rôle de régulation positive de la transcription.
• Les histones déméthylases incluent "Jumonji domain-containing 2C" (JMJD2C aussi appelée KDM4C) et JMJD1A (aussi appelée KDM3A) : elles ont un rôle de régulation négative de la transcription.
• EZH1 et EZH2 (appelés "bivalent domains") : "Polycomb proteins Enhancer of zeste homologue 1 and 2" (histone-lysine N-méthyltransférases)
• TIP60 (aussi appelée KAT5) : "TAT-Interacting protein of 60 kDa" (acétylation des histones)
• NuRD ("Nucleosome-Remodeling and Histone Deacetylase chromatin-remodeling complexes") : Histone désacétylases 1 et 2 (HDAC1 and HDAC2) - "Chromodomain-Helicase-DNA-binding proteins CHD3 and CHD4" (ATPase)
• DNMT3A : DNA (cytosine-5)-méthyltransférase 3A

Autres facteurs qui ont un rôle sur l'état de condensation de la chromatine

α. Les polyamines, en particulier la putrescine, la spermidine (4+) et la spermine (8+), sont des petits polycations aliphatiques linéaires impliquées dans de nombreuses fonctions biologiques.

Les polyamines sont très présentes dans le noyau et elles ont des propriétés de compactage de la chromatine. En effet, ils semblent que les polyamines s'auto-assemblent avec des ions phosphates dans le noyau et génèrent des composés appelés agrégats de polyamines nucléaires ("Nuclear Aggregates of Polyamines") qui interagissent avec l'ADN génomique.

La putrescine est synthétisée par l'ornithine décarboxylase et les deux autres polyamines sont des dérivés de la putrescine.

β. Les protéines de maintien des chromosomes ("Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) proteins") : leurs rôles n'est pas encore clairement défini mais elles ont une incidence sur la régulation de l'état de compacité de la chromatine au cours de certaines phases du cycle cellulaire (en particulier l'interphase).

Les Eukaryotes possèdent au moins six protéines SMC différentes (Smc1 à Smc6) qui s'hétérodimèrisent sélectivement pour former trois complexes SMC :

• la cohésine (complexe Scc1, Scc3, Smc1 - Smc3)
• la condensine (complexe Smc2 - Smc4)
• le complexe (Smc5 - Smc6)

La condensine contribue notablement à l'enroulement et au repliement progressifs des fibres de chromatine au moment de la préparation de la mitose. Elle participe également à la régulation de la transcription des gènes à l'interphase.

L'état de condensation des fibres de chromatine résulte de deux activités : le super-enroulement dépendant de la condensine (condensation de la chromatine) et la relaxation induite par la topoisomérase (décondensation de la chromatine).

b. Epigénétique et profils épigénétiques

Une définition de l'épigénétique (épi = autour, en plus) : régulation de la transcription sans modification de la séquence de l'ADN.

De plus en plus de définitions du mot "épigénétique" sont proposées avec les avancées dans ce domaine (en particulier liées à l'héritabilité de phénotypes).

Les facteurs épigénétiques responsables du processus de remodelage de la chromatine sont :

• les modifications post-traductionnelles des histones
• la méthylation de l'ADN
• l'action des ARN non codants

Contrairement à la séquence de l'ADN, qui est en grande partie inchangée au cours de la vie, les profils épigénétiques varient non seulement d'un tissu à un autre mais changent avec l'âge et sont sensibles aux influences comportementales et environnementales (protection maternelle, pollution, qualité de la nutrition, diète, alcool, cigarette, stress, ...).

Les profils de méthylation de l'ADN en particulier (et les modifications épigénétiques en général) semblent spécifiques :

• du stade du cycle cellulaire (interphase en particulier)
• du stade de développement cellulaire : les facteurs qui déterminent les profils de méthylation de l'ADN diffèrent entre les cellules germinales et les cellules somatiques
• du type de tissus
• du stade de développement de l'individu (foetus, embryon, adulte)

Les mécanismes épigénétiques contribuent donc à l'identité de chaque type de cellule (plus de 200 types de cellule ont été recensés chez l'homme).

Les protéines très conservées du groupe Polycomb (PcG) et du groupe Trithorax (TrxG) peuvent conférer une mémoire héritable à long terme : les deux phases du cycle cellulaire au cours de laquelle la "mémoire épigénétique" est la plus susceptible d'être effacée sont la réplication de l'ADN et la mitose.

• Au début de la mitose, la membrane nucléaire se décompose et les protéines du noyau sont libérées dans le volume total de la cellule. Cela provoque une dilution importante (un facteur 4 chez Drosophila melanogaster) et rapide des protéines.
• Au cours de la métaphase, la chromatine atteint son degré de condensation maximal (300 fois plus condensée). Chez Drosophila melanogaster, le volume occupé par la chromatine est 8 fois plus faible que celui qu'elle occupe pendant l'interphase.

Ces changements de concentration des protéines et de volume de la chromatine ont des effets importants sur la cinétique de fixation des protéines qui contrôlent la structure de la chromatine. Les protéines PcG et TrxG se fixent sur la chromatine au cours de la mitose mais les protéines TrxG restent davantage fixées. L'acétylation et l'ubiquitinylation des histones est réduite au cours de la mitose, les méthylations H3K4 et H3K27 sont inchangées et certaines phosphorylations sont accrues.

À l'échelle qui s'échelonne des kilo- paires de bases aux méga- paires de bases (échelle qui englobe la taille des gènes, des groupes de gènes et des domaines de régulation), l'organisation tridimensionnelle de l'ADN est impliquée dans les mécanismes de régulation de la transcription des gènes.

A cette échelle, le génome est subdivisé en domaines qui sont dans différents états épigénétiques : états actifs du point de vue de la transcription, états inactifs ou états réprimées par des protéines du groupe Polycomb (Boettiger et al., 2016).

Début 2015, le "NIH Roadmap Epigenomics Consortium" a généré et analysé la plus grande collection d'epigénomes humains de cellules primaires et de tissus (analyse intégrative de 111 épigénomes humains de référence).

Ces données ont apporté un très grand nombre d'informations quant aux profils de modification des histones, à l'accessibilité et la méthylation de l'ADN, à l'expression des ARN. Ces données ont permis d'établir des cartes globales d'éléments régulateurs et de définir des modules régulateurs de l'activité coordonnée avec leurs activateurs et leurs répresseurs probables.

L'ensemble des résultats démontrent que des variants génétiques associés à des traits et à des maladies sont enrichis en marques épigénomiques spécifiques des tissus, ce qui établit une corrélation entre des types de cellules biologiquement pertinents et divers traits humains.

Roadmap Epigenomics Consortium et al. (2015) "Integrative analysis of 111 reference human epigenomes" Nature 518, 317–330

Les histones H2A, H2B, H3 et H4 ("core histones") forment le coeur de la structure octamérique impliquée dans les nucléosomes.

Les histones H1 et H5 sont appelées histones de liaison ("linker histones").

Source : Graff & Mansuy (2008)

Le nucléosome contient 2 molécules de chaque histone H2A, H2B, H3 et H4 assemblées en deux hétérodimères [H2A-H2B] et un hétérotétramère [H3-H4].

Les histones adoptent un repliement qui leur est caractéristique ("histone fold") : 3 hélice α reliées par 2 boucles.

Les histones forment des dimères via des interactions entre leurs longues hélices α2 (orientation anti-parallèle)

Source : Das et al. (2010)

Deux dimères [H3-H4] forment un faisceau de 4 hélices stabilisé par des interactions [H3-H3’].

L'hétérodimère [H2A/H2B] se fixe à l'hétérotétramère [H3-H4] via des interactions entre H2B et H4.

Interactions inter-nucléosomes dans les fibres de chromatine isolées

Les nucléosomes adjacents sont liés par une partie de l'ADN appelé ADN de liaison ("linker DNA") dont la longueur varie de 10 à 80 paires de base selon l'espèce ou le type de tissu. La longueur moyenne de l'ADN de liaison chez les vertébrés est 35 paires de bases.

Les études (Shogren-Knaak et al., 2006) des effets de la perte de la charge positive de K16 de l'histone H4 (par acétylation) ont montré l'importance des contacts inter-nucléosomes entre l'extrémité N-terminale (chargée positivement) de l'histone H4 et la partie riche en acides aminés acides d'une partie de l'histone H2A.

Rôle physique de chaque extrémité N-terminale d'histones dans le repliement de la chromatine (Arya & Schlick, 2006)

• (i) le rôle prédominant des extrémités N-terminales des histones H4 dans la médiation des interactions inter-nucléosome
• (ii) le rôle important des extrémités N-terminales des histones H3 dans la détection des répulsions électrostatiques entre les ADN de liaison entrant et sortant et dans la médiation des interactions inter-nucléosome
• (iii) le rôle spécialisé des extrémités N-terminales des histones H2A/H2B dans la médiation des interactions fibre/fibre et l'oligomérisation

Ces interactions induisent collectivement un arrangement global hélicoïdal en "zig-zag" où les nucléosomes interagissent fortement avec leurs quatrième nucléosome voisin.

Rôle des histones au sein des nucléosomes

• H1 est une histone de liaison qui est liée à partir à l'extérieur du nucléosome. Elle facilite la compaction de la chromatine : les variants sont regroupées en condensateurs solides, intermédiaires et faibles de la chromatine.
• H2B : il y a relativement peu de modifications post-traductionnelles recensées pour l'histone H2B par rapport aux autres histones du coeur des nucléosomes. Il y a aussi peu de littérature sur les variants de l'histones H2B : il semble qu'elle soit sous-étudiée.
• H3 porte un très grand nombre de sites de modifications post-traductionnelles, liées à divers processus cellulaires. Certaines modifications, comme H3K4me sont utilisées comme une marque universelle de l'activation de la transcription, tandis que H3K9me et H3K27me sont des marques universelles de la répression de la transcription.
• H4 est l'histone la plus conservée et sert de site d'ancrage des autres histones. Elle est incorporée dans le nucléosome par la protéine chaperone Asf1 sous forme d'un dimère H3-H4.
• Il semble que l'histone H5 ait la même fonction que l'histone H1 et contribue à la condensation des chaînes de nucléosomes en structures d'ordre supérieur. L'histone H5 remplace l'histone H1 dans certaines cellules.

Les histones de liaison sont associées à l'ADN de liaison. Elle protègent partiellement (environ 20 paires de bases) l'ADN de liaison de l'action des nucléases. L'histone H1 contient une région globulaire conservée et une extrémité C-terminale riche en lysines capable d'interagir fortement avec l'ADN.

Visualisation du nucléosome de Xenopus laevis à une résolution de 2,8 Å

Code PDB : 1AOI

Complexe histones [H3,H4,H2A,H2B] et un fragment d'ADN de 146 paires de base.

3. Modifications post-traductionnelles des histones

L'extrémité N-terminale de la chaîne polypeptidique des histones qui émerge des nucléosomes subit de nombreuses modifications post-traductionnelles.

Source : Graff & Mansuy (2008)

La méthylation des histones se produit principalement sur les chaînes latérales des lysines et arginines. Contrairement à l'acétylation et la phosphorylation, la méthylation ne modifie pas la charge des histones.

Il y a un niveau supplémentaire de complexité en ce qui concerne la méthylation :

• les lysines peuvent être mono-, di- ou tri-méthylées
• les arginines peuvent être mono-méthylées ou di-méthylées de manière symétrique ou asymétrique

La phosphorylation et l'acétylation des histones diminuent la charge positive des histones ce qui diminue les interactions électrostatiques entre l'ADN et les histones. La chromatine est moins compacte et l'accessibilité des protéines de la machinerie de la transcription est augmentée.

L'ubiquitinylation ajoute une très grosse molécule aux histones, induisant ainsi un profond changement de la conformation général du nucléosome, qui à son tour modifie les interactions intra-nucléosomique et/ou les interactions avec d'autres complexes liés à la chromatine.

La coupure de l'extrémité N-terminale saillante des histones (perte des 21 premiers acides aminés de H3) a des effets similaires.

La sérotonylation

• a. La sérotonine (5-hydroxytryptamine) active un récepteur membranaire qui déclenche une cascade de signalisation intracellulaire qui débouche sur une modification de la chromatine et donc de la transcription de certains gènes.
• b. L'internalisation de la sérotonine par des transporteurs spécifiques active les transglutaminases dépendantes du calcium ("calcium-dependent transglutaminase" - TGases) dans le cytoplasme. Ces enzymes ajoutent une molécule de sérotonine (sérotonylation) à certaines petites GTPases comme Rab.

Source : Cervantes & Sassone-Corsi (2019)

c. Dans le noyau :

• La sérotonylation a lieu aussi, indépendamment du récepteur de la sérotonine.
• La transglutaminase 2 (TGM2) ajoute la sérotonine à la glutamine 5 (Q5ser) de l'histone H3.
• Cette modification post-traductionnelle a lieu en association avec la triméthylation de la lysine 4 (K4me3) de l'histone H3 par des méthyl-transférases telles que MLL1 (groupe méthyle de la S-adénosylméthionine).
• Le double marquage [Q5ser / K4me] pourrait renforcer l'état transcriptionnellement actif de la chromatine.

Les modifications post-traductionnelles des histones ont des incidences les unes sur les autres (elles peuvent s'exclure ou au contraire s'induirent mutuellement). Cette interférence entre les différentes modifications post-traductionnelles contribue probablement à affiner le contrôle étroit de la structure de la chromatine.

4. Signatures de la chromatine au niveau des gènes transcrits

La tri-méthylation de la lysine 4 de l'histone H3 (H3K4me3) est une modification caractéristique de la chromatine au niveau des promoteurs qui contrôlent des gènes activement transcrits chez les eucaryotes (de la levure à l'homme).

Cette modification s'effectue sur les nucléosomes bordant des régions sans nucléosome et qui coïncident avec les sites de démarrage de la transcription ("transcription start sites" - TSS) des gènes transcrits.

Les modifications H3K4me1 (mono-méthylation), H3K4me3 (tri-méthylation) et H3K36me3 (tri-méthylation) sont les marques respectives des :

• enhancers "actifs"
• des promoteurs "actifs"
• des exons "actifs"

Le complexe "Set1-containing COMPASS" est recruté sur les promoteurs "actifs" via le facteur d'élongation Paf1 ("RNA polymerase II-associated factor 1"). Ce complexe occupent les régions activement transcrites et son recrutement dépend aussi de la forme active de l'ARN polymérase II (dont la sérine 5 est phosphorylée).

L'histone méthyltransférase SET1 méthyle spécifiquement la lysine 4 de l'histone H3 sauf si la lysine 9 est déjà méthylée. Elle catalyse la réaction : S-adénosyl-L-méthionine + L-lysine-[histone] ===> S-adénosyl-L-homocysteine + N(6)-méthyl-L-lysine-[histone].

La tri-méthylation H3K4me3 au niveau des promoteurs "actifs" nécessitent une autre modification d'histone : la mono-ubiquitinylation de la lys 123 de l'histone H2B catalysée par [Rad6- Bre1].

Deux familles de protéines (le groupe trithorax et le groupe Polycomb) contiennent des protéines associées à la chromatine et qui participent à l'activation ou à la répression de la transcription. Les protéines de ces deux familles contiennent un motif de 130 - 140 acides aminés, appelé domaine SET ["Su(var)3-9, Enhancer of zeste [E(z)] and trithorax (trx)"].

Voir : "The Polycomb and Trithorax page".

COMPASS ("Complex Proteins Associated with Set1"), est un complexe de 7 chaînes polypeptidiques (de 25 à 130 kDa). Il existe au moins six homologues de COMPASS chez les mammifères (les complexes MLL1-4, hSET1A et hSET1B).

La phosphorylation de Tyr 57 (hautement conservée) de l'histone H2A par par l'activité tyrosine kinase insoupçonnée de la caséine kinase 2 (CK2) régule l'étape d'allongement de la transcription. Ce processus est conservé de la levure aux mammifères.

CK2α (la sous-unité catalytique de CK2) se fixe sur des gènes transcrits par l'ARN polymérase II et des "enhancers" actifs.

Du point de vue du mécanisme, l'inhibition de CK2 ou la mutation Y57F de l'histone H2A augmente l'activité de dés-ubiquitinylation (de l'histone H2B) par le complexe acétyltransférase Spt-Ada-Gcn5 (SAGA). Ce résultat suggère un rôle essentiel de cette phosphorylation dans la coordination de l'activité du complexe SAGA lors de la transcription.

Voir Basnet et al. (2014).

5. Les protéines "writers"

a. Les histone lysine acétyltransférases (HAT)

Il existe deux grandes classes de HAT (EC 2.3.1.48) :

• Les HAT de type B sont essentiellement cytoplasmiques, elles acétylent les histones libres mais pas celles déjà inclues dans la chromatine. Elles acétylent K5 et K12 des histones H4 néo-synthétisées.
• Les HAT de type A forment une famille d'enzymes plus diversifiée que les HAT de type B. Elles peuvent être classées en au moins 3 groupes distincts selon leur homologie de séquence d'acides aminés et leur structure :
  1. le groupe GNAT ("Gcn5-related N-acetyltransferases") : présence d'un bromodomaine, elles acétylent les lysines des histones H2B, H3 et H4.
  2. le groupe MYST : présence de motifs en doigt de zinc et de chromodomaines, elles acétylent les lysines des histones H2A, H3 et H4. Exemple : Tip60 ("Tat-interactive protein, 60 kDa")
  3. le groupe CBP/p300 : présence de motifs en doigt de zinc et d'un bromodomaine. Le domaine catalytique n'a pas d'homologie de séquences avec les domaines catalytiques des autres HAT. Plusieurs co-activateurs de récepteurs nucléaires interagissent avec CBP/p300 : SRC-1 ("Steroid Receptor Coactivator 1"), ACTR ("nuclear receptor coactivator 3"), TIF-2 ("Transcriptional Intermediary Factor 2 aussi appelé GRIP1).

Voir un tableau des abréviations et noms de protéines impliquées dans l'épigénétique.

Réaction catalysée : acétyl-CoA + [histone] <=> CoA + acétyl-[histone]

Les HAT utilisent l'acétyl-CoA comme cofacteur et catalysent le transfert d'un groupe acétyle sur le groupement ε-aminé des chaînes latérales de lysine.

La charge positive de la lysine est neutralisée ce qui affaiblit les interactions entre les histones et l'ADN.

b. Les histone lysine méthyltransférases (HKMT)

Il existe deux types de HKMT (EC 2.1.1.43) :

• Les HKMT qui contiennent un domaine SET ["(Su(var)3-9, Enhancer of Zeste [E(Z)], and Trithorax (trx))"] - environ 130 acides aminés, riche en feuillets β] qui possède l'activité catalytique.

• Les HKMT qui n'en contiennent pas ("non-SET domain-containing histone methyltransferase") et utilisent l'enzyme Dot1 ("Disruptor of telomeric silencing" aussi appelée Kmt4). Contrairement à SET, Dot1 méthyle la lysine 79 au coeur de l'histone H3 (H3K79) et non pas à l'extrémité N-terminale saillante du nucléosome. Elle est la seule enzyme connue à agir à cet endroit. L'histone H3 est la seule histone que Dot1 méthyle. L'action de Dot1 a des incidences sur de de nombreux processus biologiques (développement de l'embryon, fonction cardiaque, érythropoiese, ...).

Voir un tableau des abréviations et noms de protéines impliquées dans l'épigénétique.

Toutes les HKMT catalysent le transfert d'un groupement méthyle de la S-adénosylméthionine sur le groupement ε-aminé d'une lysine :

S-adénosyl-L-Met + histone L-Lys => S-adénosyl-L-homocysteine + histone N₆-méthyl-L-Lys

La dérégulation des lysine méthyltransférases est associée à de nombreuses maladies. Des progrès significatifs ont été réalisés dans le développement de médicaments qui ciblent ces enzymes.

• Par exemple, l'inhibiteur appelé tazemetostat, a été approuvé pour le traitement de certaines pathologies.
• C'est un inhibiteur de EZH2 ("Enhancer of Zeste Homologue 2"), la principale sous-unité catalytique du complexe Polycomb 2, un complexe de régulation épigénétique qui triméthyle H3K27 pour réprimer la transcription.
• Le tazemetostat est un inhibiteur compétitif de la S-adénosylméthionine (le groupement donneur de méthyle).

c. Les histone arginine méthyltransférases (PRMT)

Ces enzymes (EC 2.1.1.125) catalysent le transfert d'un groupement méthyle de la S-adénosylméthionine sur le groupe ω-guanidino de l'arginine :

S-adénosyl-L-Met + Arg-[histone] <=> S-adénosyl-L-homocysteine + N(omega)-méthyl-Arg-[histone]

Il existe deux classes de PRMT :

• le type I méthyle l'arginine de manière asymétrique l'arginine (N,N-diméthylation). Membres du type I : CARM1, PRMT1, PRMT2, PRMT3, PRMT6 et PRMT8.
• le type II méthyle l'arginine de manière symétrique (N,N'-diméthylation). Membres du type II : PRMT5 et PRMT7.

Exemples de spécifcité :

• CARM1 catalyse la mono-méthylation et la di-méthylation asymétrique de R17 de l'histone H3.
• PRMT5 ("Protein arginine N-methyltransferase 5") méthyle R3 des histones H2A et H4 au cours du développement des cellules germinales et méthyle R8 de l'histone H3 ce qui réprimerait la transcription.

Voir un tableau des abréviations et noms de protéines impliquées dans l'épigénétique.

d. Autres types de protéines "writers" : arginine déiminases, lysine biotinases, lysine ribosylases, lysine ubiquitinases, sérine/thréonine/tyrosine kinases.

Voir la base de données :"HIstome".

6. Les protéines "erasers"

a. Les histone lysine désacétylases (HDAC)

Les HDAC réversent l'acétylation de la lysine par les HAT, ce qui restaure la charge positive de la lysine.

Il existe quatre classes d'HDAC (EC 3.5.1.98) :

• les classes I et II contiennent des enzymes qui sont plus homologues à scRpd3 et scHda1 (levure), respectivement.
• la classe IV ne contient qu'un membre actuellement : HDAC11.
• les HDAC de la classe III (appelées sirtuines) sont homologues à Sir2 (levure). Contrairement aux HDAC des trois autres classes, celles de la classe III nécessitent le NAD⁺ comme cofacteur.

Voir un tableau des abréviations et noms de protéines impliquées dans l'épigénétique.

b. Les histone lysine déméthylases (HLD)

Il existe deux classes principales d'HLD :

• LSD déméthylases : elles déméthylent les lysines mono- et di-méthylées par une réaction d'oxydation d'amine dépendante de la flavine adénine dinucléotide (FAD). La perte du groupe méthyle passe par un intermédiaire imine qui est hydrolysé en formaldéhyde par un processus non enzymatique.

• Les JHDM ("Jumonji Domain-containing Histone Demethylases" - ou JMJC selon les nomenclatures) : dioxygénases qui déméthylent les lysines mono-, di- et tri-méthylées par un mécanisme oxydatif nécessitant Fe(II) et l'α-cétoglutarate comme cofacteurs. La déméthylation s'opère par hydroxylation directe du groupe méthyle qui forme un intermédiaire hydroxyméthyle instable qui se transforme spontanément en formaldéhyde.

Les histone lysine déméthylases ont des spécificités précises. La première histone lysine déméthylase à FAD identifiée (en 2004) et a été nommée "Lysine-specific demethylase 1" (LSD1 aussi appelée KDM1A). Elle :

• déméthyle K4 et K9 mono-méthylées de l'histone H3
• déméthyle K4 di-méthylées de l'histone H3
• nécessite la présence du co-répresseur RCOR1/CoREST pour déméthyler K4

La "Lysine-specific demethylase 4A" ou JHDM3A :

• déméthyle spécifiquement K9 et K36 tri-méthylées de l'histone H3
• ne déméthyle pas K4 et K27 de l'histone H3, ni K20 de l'histone H4
• ne déméthyle pas les lysines mono- et di-méthylées

La "Lysine-specific demethylase 6A" - KDM6A déméthyle spécifiquement K27 di- et tri-méthylée de l'histone H3 mais ne déméthyle pas K27 mono-méthylée. La déméthylation de K27 est concomitante avec la méthylation K4 de l'histone H3 et elle régule le recrutement du complexe PRC1 et la mono-ubiquitinylation de l'histone H2A.

Voir un tableau des abréviations et noms de protéines impliquées dans l'épigénétique.

c. Les histone arginine déméthylases (HRDM)

Les HRDM sont des dioxygénases nécessitant Fe(II) et l'α-cétoglutarate comme cofacteurs et qui peuvent agir en tant qu'histone arginine déméthylase ou en tant que lysyl-hydroxylase (voir histone lysine déméthylases).

Exemple de spécificité : JMJD6 ("Jumonji domain-containing 6 protein") déméthyle R2 de l'histone H3 et R3 de l'histone H4.

d. Autres types d'enzymes "erasers" : lysine déribosylase, lysine déubiquitinases, sérine/thréonine/tyrosine phosphatases.

Voir la base de données :"HIstome".

e. Synthèse d'acétyl-CoA et modulation de la transcription

Source : Ashley Watson & Tsai (2017)

Chez la souris, ACSS2 se fixe sur la chromatine dans des neurones différenciés ou matures. ACSS2 se fixe à proximité de séquences d'ADN qui contrôlent la transcription de gènes qui régulent la différenciation ou la consolidation de la mémoire à long terme.

• Les histone acétyltransférases (HAT) transfèrent un groupement acétyle (Ac) de l'acétyl-CoA aux histones (ce qui libère du coenzyme A -CoA). Cette acétylation déroule la chromatine et permet la transcription des gènes. La fixation d'ACSS2 sur la chromatine augmenterait donc la concentration locale d'acétyl-CoA disponible pour HAT.
• Les histone désacétylases (HDAC) éliminent les groupements acétyles des histones ce qui constitue une source d'acétate pour la synthèse ultérieure d'acétyl-CoA.

7. Domaines protéiques d'interaction avec les histones modifiées

Il existe un très grand nombre de protéines associées à la chromatine. Elles interagissent spécifiquement avec les histones modifiées par l'intermédiaire de nombreux domaines distincts.

Source : Bannister & Kouzarides (2011)

Ces domaines permettent la reconnaissance simultanée de plusieurs types de modifications post-traductionnelles et d'autres fonctions des nucléosomes.

Les types de domaines reconnaissant la méthylation de la lysine sont les plus nombreux, reflétant probablement l'importance relative de cette modification post-traductionnelle.

Exemple de mécanisme de reconnaissance entre enzyme de modification des histones et nucléosome

PRC1 ("Polycomb repressive complex 1") agit avec les autres complexes protéiques du groupe Polycomb pour réprimer la transcription de nombreux gènes qui contrôlent les processus du développement chez les animaux.

PRC1 peut compacter la chromatine et inhiber le remodelage d'un nucléosome par un mécanisme non enzymatique.

Cependant, PRC1 semble agir également par un processus enzymatique d'ubiquitinylation. Six formes de PRC1 ont été identifiées chez les mammifères : toutes contiennent deux protéines qui possèdent un domaine structural appelé RING ("Really Interesting New Gene"). Ce type de domaine lie le zinc et est souvent trouvé dans la structure de protéines impliquées dans l'ubiquitinylation.

Une structure cristallographique (McGinty et al., 2014) montre que l'association des enzymes [Ring1B - Bmi1] qui fait partie du complexe répressif PRC1, positionne une autre enzyme, UbcH5c, juste au-dessus de Lys 119 de l'histone H2A, permettant la mono-ubiquitinylation de Lys 119.

Le schéma ci-dessous montre le nucléosome et la partie de caractère acide ("acidic patch") formée par les histones H2A et H2B.

Source : Müller & Müller (2014)

Lys 119, Lys 124, Lys 127 et Lys 129 de l'histone H2A sont indiquées par des cercles jaunes. Ring1B : enzyme "Ubiquitin ligase E3"; Bmi1 : "Polycomb-group RING finger (PCGF) protein"; UbcH5c : enzyme "Ubiquitin-conjugating enzyme E2"

La Lys 119 mono-ubiquitinylée crée alors un site de fixation pour le complexe histone-méthyltransférase PRC2 et favorise ainsi l'addition de 3 groupes méthyles sur Lys 27 de l'histone H3, cette modification étant capitale pour la répression de la transcription des gènes cibles de Polycomb.

8. La méthylation - déméthylation de l'ADN

a. Formation de la 5-méthyl-cytosine (5mC)

L'autre grande modification épigénétique est la méthylation de l'ADN. Elle est essentielle pour la régulation de la transcription, pour éteindre les éléments rétroviraux, pour l'empreinte génomique et pour l'inactivation du chromosome X, ...

La méthylation de l'ADN est catalysée par une famille d'ADN méthyltransférases ("DNA methyltransferases" - DNMT) qui transfèrent un groupe méthyle de la S-adénosyl-méthionine (SAM) sur le carbone en position 5 d'une cytosine pour former la 5-méthyl-cytosine (5mC).

b. Les ADN méthyltransférases

Méthylation d'entretien

L'ADN méthyltransférase DNMT1 se positionne au niveau de la fourche de réplication de l'ADN et copie le profil de méthylation de l'ADN parental sur le brin néo-synthétisé. Elle est capable de réparer les erreurs de méthylation de l'ADN. Elle est aussi appelée méthylation d'entretien ("maintenance DNMT").

Méthylation de novo

Les ADN méthyltransférases DNMT3a et DNMT3b (de structure similaire à DNMT1) peuvent mettre en place un nouveau profil de méthylation de l'ADN non modifié et sont ainsi appelées "de novo DNMT". Leur activité peut-être modulée par un membre de cette famille, catalytiquement inactif : DNMT3L.

Domaines fonctionnels prédits au sein des protéines (de souris) impliquées dans la méthylation de novo et la méthylation d'entretien.

Source : Wu & Zhang (2014)

L'ADN méthylé est reconnu par 3 familles de protéines qui sont les partenaires obligatoires des DNMT :

• Protéines UHRF1 et 2 ("Ubiquitin-like plant homeodomain and RING Finger domain"). UHRF1 est le partenaire obligatoire de DNMT1 et reconnaît les ilots CpG semi-méthylés.
• Protéines MBD ("Methyl-CpG-Binding Domain") : MeCP2, MBD1, MBD2, MBD3 et MBD4.
• Protéines à doigt de zinc : Kaiso, ZBTB4 et ZBTB38.

La déméthylation

Domaines fonctionnels prédits au sein des protéines (de souris) impliquées dans l'oxydation de la 5mC et l'excision [5fC / 5caC].

Source : Wu & Zhang (2014)

• ADD : ATRX-DNMT3-DNMT3L; PWWP : motif Pro-Trp-Trp-Pro; MTase: domaine ADN méthyl-transférase
• BAH : bromo-adjacent homology; PHD : Plant homeodomain; UBL : ubiquitin-like domain.

Méthylation et déméthylation par oxydations successives de la 5mC par les protéines TET ("Ten-Eleven Translocation") :

Toutes les protéines TET possèdent un domaine catalytique C-terminal qui contient une région riche en Cys et un grand domaine à hélice β double brin (DSBH - "Double-Stranded β-Helix"). Les protéines TET1 et TET3 contiennent également un domaine N-terminal en doigt de zinc (motif CXXC).

L'excision des bases ("base-excision repair" - BER) est catalysée par l'ADN thymine glycosylase ("Thymine DNA glycosylase" - TDG) qui contient un domaine "Uracile DNA glycosylase" (UDG).

Exemples d'autres modifications covalentes de l'ADN

• 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), 5-carboxylcytosine (5caC), α-putrescinylthymine (putThy).
• Voir DNAmod : base de données de modifications chimiques de l'ADN.

c. Les ilots CpG

L'essentiel des sites de méthylation de l'ADN se situent sur des cytosines qui précèdent une guanine (CpG - le "p" signifie phosphate).

Les ilots CpG sont des fragments d'ADN d'au moins 200 paires de base, riches en GC et dont la proportion en CpG est plus élevée que dans le reste du génome. Ils contiennent moins de nucléosome.

Les génomes des mammifères sont généralement caractérisés par un grand déficit en CpG (sous-représentés). Par exemple, le rapport [CpG^observés / CpG^attendus] est d'environ 0,20 - 0,25 dans les génomes de l'homme et de la souris.

En effet :

• La désamination de la cytosine forme l'uracile qui est facilement reconnue comme étrangère dans un brin d'ADN et est remplacée.
• La désamination de la méthylcytosine forme la thymine, moins facilement reconnue comme étrangère et sujette à hyper-mutation en TpG (ou CpA sur le brin complémentaire) et à une diminution dans le génome.

Dans le génome humain, 60% à 80% des 28 millions d'ilots CpG recensés sont méthylés dans les cellules somatiques. Chez les mammifères, une proportion importante des promoteurs se situent dans des ilots CpG et/ou possèdent une forte teneur en CpG.

Certains sites non-CpG peuvent être aussi méthylées mais la méthylation des cytosines de type CpH (H = A, T ou C) a lieu surtout chez les plantes et très peu chez les mammifères.

Le schéma ci-dessous illustre l'état de la chromatine au niveau des ilots CpG pour des gènes transcrits.

Les ilots CpG pour des gènes transcrits sont généralement :

• non méthylés
• la densité des nucléosomes est plus faible
• les histones sont modifiées par acétylation
• par ailleurs :
  1. La modification H3K4me3 est une signature des promoteurs au sein d'ilots CpG (interactions de H3K4me3 avec des protéines de la machinerie de la transcription). La méthylation H3K4me3 est médiée par CFP1 ("CXXC Finger Protein 1", aussi appelée CGBP - composant du complexe SET1-H3K4 méthyl-transférase) qui se fixe spécifiquement sur les CpG non-méthylés.
  2. Les histones sont aussi caractérisés par une dépletion de la modification H3K36me2. L'histone H3K36me2-déméthylase KDM2A (également protéine CXXC) se fixe aussi spécifiquement sur les CpG non-méthylés.

Facteurs de transcription sensibles à la méthylation de leur site de fixation

Certains motifs de fixation à l'ADN n'ont pas encore de facteurs de transcription identifiés : c'est le cas notamment de l'élément CGCG associé à des gènes fortement transcrits dans les tissus humains et très présent près du site de début de transcription d'un sous-ensemble d'ilots CpG.

La protéine nucléaire associée à BTG3 ("BTG3-Associated Nuclear Protein" - BANP) est un facteur de transcription qui se fixe sur cet élément dans le génome de la souris et de l'homme :

• BANP est un puissant activateur d'ilots CpG qui contrôle des gènes du métabolisme et la recombinaison V(D)J pendant le développement des cellules T.
• La méthylation de ce motif ADN empêche la fixation de BANP. Inversement, en se liant à un motif non méthylé, BANP ouvre la chromatine.
• Grand et al. (2021)

9. Régulation par les ARN non codants

a. La méthylation de novo de l'ADN dirigée par les siARN chez les plantes

Les noyaux des Eucaryotes contiennent 3 complexes ARN polymérases ADN-dépendantes [nucléoside triphosphate + ARN(n) => diphosphate + ARN(n+1)]:

• l'ARN polymérase I (Pol I) transcrit les grands ARN ribosomiques
• l'ARN polymérase II (Pol II) transcrit les précurseurs des ARN messagers
• l'ARN polymérase III (Pol III) transcrit les ARN de transfert et l'ARN ribosomique 5S

Les plantes possèdent 2 ARN polymérases supplémentaires appelées Pol IV et Pol V, toutes deux ayant évolué à partir de Pol II et qui sont spécialisés dans la méthylation de l'ADN dirigée par les ARN ("RNA-directed DNA methylation" - RdM).

Pol II, Pol IV et Pol V sont constituées de 12 sous-unités dont beaucoup sont communes à ces trois polymérases.

Chacune possède également des sous-unités qui leur sont spécifiques. Ces sous-unités sont nommés ARN polymérase nucléaire B ("Nuclear RNA Polymerase B " - NRPB) pour les sous-unités spécifiques de Pol II, NRPD pour les sous-unités spécifiques de Pol IV et NRPE pour les sous-unités spécifiques de Pol V.

Schématiquement, les étapes de la RdM sont les suivantes :

• Les transcrits synthétisés par Pol IV sont convertis en longs ARN double brins par Pol II, puis maturés en siARN ("24-nucleotide small interfering RNA") par l'enzyme DICER-like 3 (DCL3) et exportés vers le cytoplasme.
• L'un des brins de ces siRNA est chargé sur la protéine Argonaute 4 (AGO4 - formation d'un complexe [AGO4/NRPE1/siRNA]). Ces siRNA sont ré-importés dans le noyau où ils interagissent avec des longs ARN non-codants ("long non-coding RNA" - lncRNA) synthétisés par Pol V.
• Ce ciblage déclenche l'activité d'ADN méthyltransférases qui catalysent la méthylation de novo des cytosines dans tous les contextes de séquences (c'est-à-dire : CpG, CpHpG et CpHpH, où H représente A, C ou T), contrairement aux animaux chez qui elle a lieu principalement au niveau d'ilots CpG.
• Il en résulte une répression de la transcription ("Transcriptional Gene Silencing") aux niveau des loci génomiques transcrits par Pol V, en particulier les transposons et autres séquences répétitives de l'ADN.

Voir un cours sur l'interférence ARN (siARN et miARN).

Ce processus d'une très grande complexité, dont on commence à décrypter les mécanismes, met en jeu des dizaines de protéines. Par exemple :

• SHH1 ("Sawadee Homeodomain Homologue 1") : se fixe sur H3K9me2 et recrute Pol IV
• RDR2 ("RNA-Dependent RNA Polymerase 2") : ARN polymérase ARN-dépendante 2
• DRM1 et DRM2 ("Domains Rearranged Methyltransferases 1 and 2") : méthylation de novo de l'ADN
• CMT3 ("ChromoMethylase 3") : ADN méthyltransférase qui agit sur les cytosines des séquences CHG (où H représente A, C ou T)
• SUVH4 ("SU(Var) Homologue 4") : histone méthyltransférase (spécifique de la diméthylation H3K9me2, marque épigénétique de la répression de la transcription)

En absence de la protéine "Decreased DNA Methylation 1" (DDM1), une voie RdDM non-classique impliquant Pol II et RDR6 génère des ta-siRNAs ("21 nucleotide trans-acting small interfering RNA" - dérivés de transcrits endogènes TAS1, TAS2 et TAS3) qui guident la méthylation de novo de l'ADN.

Voir une revue : Matzke & Mosher (2014)

b. Régulation épigénétique par les longs ARN non-codants ("Long noncoding RNA" - lncRNA)

La découverte récente de très nombreux lncRNA associés à des complexes spécifiques de modification de la chromatine tels que PRC2 ("Polycomb Repressive Complex 2") qui médie la triméthylation H3K27me3, suggère des rôles importants de nombreux lncRNA dans la régulation des états de la chromatine.

Source : K. Morris

• Certains lncRNA agissent en cis sur des gènes voisins.
• D'autres lncRNA agissent en trans et régulent des gènes lointains. L'un des exemples les mieux connus est le lncRNA HOTAIR. Le gène HOTAIR ("HOX transcript antisense RNA" - 6232 paires de base) est situé au sein du groupe de gènes HOXC sur le chromosome 12 humain. Il code le lncRNA HOTAIR (environ 2200 paires de base) qui réprime la transcription du locus HOXD situé sur le chromosome 2.

Source : adapté de Tsai et al. (2010)

• les protéines du complexe PRC2 : les méthylases (H3K27) EZH2, SUZ12 et EED fixent l'extrémité 5' de HOTAIR
• le complexe [LSD1/CoREST/REST] fixe son extrémité 3'

En recrutant ces protéines, HOTAIR dirige leur action de remodelage. Il en résulte une modification de la triméthylation de la chromatine (triméthylation H3K27me3 et perte de la méthylation H3K4 activante).

Un lncRNA peut donc servir d'échafaudage pour des enzymes de modification des histones afin de contrôler la transcription de gènes cibles.

c. Rôle possible des boucles R dans la terminaison de la transcription

Au cours de la transcription, la molécule d'ARN en cours de biosynthèse sort de l'ARN polymérase, ce qui rompt son appariement avec les bases complémentaires du brin d'ADN matrice. Cependant, l'ARN naissant est susceptible de se ré-hybrider au brin d'ADN transcrit, créant ainsi un hybride ARN-ADN stable et laissant le brin d'ADN non transcrit (qui a la même séquence que le brin d'ARN néo-synthétisé - l'uracile remplaçant la thymine) sous la forme d'un brin étendu non protégé.

Cette structure, appelée boucle de type R ("R-loop" - triple brins - bulle de transcription), peut avoir une longueur de plus de 1000 paires de bases pour des gènes fortement transcrits.

La formation de boucles de type R est donc une conséquence naturelle du processus de transcription. Les boucles de type R sont des intermédiaires clés de processus cellulaires spécifiques tels que la réplication du plasmide de Escherichia coli (ColE1), la réplication de l'ADN mitochondrial ou la commutation de classe d'immunoglobulines (recombinaison VDJ).

Les boucles de type R ont cependant été considérées comme de rares sous-produits de la transcription avec des effets potentiellement néfastes sur l'intégrité du génome en raison de la fragilité du brin d'ADN transcrit qui est déplacé.

Cependant, les boucles de type R ont aussi des effets bénéfiques puisque l'on observe leur formation généralisée sur des ilots CpG de promoteurs de certains gènes de l'homme. De plus, les éléments de terminaison riches en G ("G-rich ssDNA") sont enrichis en boucles de type R. Ces éléments de terminaison facilitent la pause de Pol II avant une terminaison efficace.

Un lien a été établi entre les boucles de type R et la diméthylation H3K9me2 médiée par les ARN interférents au niveau des sites de pause de la terminaison dans des gènes de mammifères codant des protéines. En effet, les gènes de mammifères qui possèdent des éléments de pause en aval de leur signal fonctionnel de poly-adénylation forment des boucles de type R au niveau des sites de terminaison.

Cela facilite la synthèse d'un transcrit anti-sens qui s'hybride avec le transcrit sens pour former un ARN double-brin ("double-strand RNA" - dsRNA). Cela déclenche le recrutement de DICER, d'AGO1 et d'AGO2.

Source : Skourti-Stathaki et al. (2014)

Figure ci-dessus

• ADN : lignes grises / ARN : ligne rouge.
• Points de contact entre le brin d'ADN et l'ARN naissant : formation d'une boucle de type R.
• Points de contact entre l'ARN sens et l'ARN anti-sens : ARN double brin.
• Pol II est représentée par une icône bleue avec une flèche blanche qui indique la direction de la transcription.
• Les nucléosomes sont indiquées en vert, sauf dans la région H3K9me2 où ils sont colorés en rouge.
• L'histone lysine méthyl-transférase G9a est aussi appelée GLP/Eu-HMTase1 chez les mammifères.

L'histone lysine méthyl-transférase G9a (qui forme un complexe hétérotrimérique avec GLP) est à son tour recrutée : elle catalyse la formation d'une marque de répression de la transcription H3K9me2.

La protéine 1γ de l'hétérochromatine ("Heterochromatin Protein 1γ" - HP1γ) est également recrutée, ce qui renforce la pause de Pol II avant une terminaison efficace de la transcription.

On peut donc supposer que les boucles de type R jouent un rôle dans l'architecture de la chromatine qui permet de définir la région de terminaison pour un certains gènes de mammifères.

10. Méthodes pour étudier les modifications épigénétiques

a. En ce qui concerne l'analyse des modifications post-traductionelles des histones et la position des acides aminés modifiés, la technique de choix est la spectromètrie de masse.

b. Il n'y a pas de méthylation quand la zebularine est incorporée dans l'ADN car c'est un inhibiteur des ADN méthyltransférases.

La zebularine induit :

• une augmentation de la fixation des ADN méthyltransférases à l'ADN par rapport à la désoxy-cytidine (et la 5-fluorodésoxy-cytidine)
• une forte diminution du taux de dissociation de l'ADN des ADN méthyltransférases

Le complexe intermédiaire covalent entre l'enzyme et l'ADN est réversible (différant ainsi des 5-fluorodésoxy)cytidines).

La zebularine est aussi un inhibiteur (analogue de l'état de transition) de la cytidine désaminase.

c. Figure ci-dessous : techniques de traitement des acides nucléiques avant séquençage pour l'analyse de parties spécifiques des génomes.

Source : ENCODE

Voir un cours sur les nouvelles technologie de séquençage à très haut débit (NGS).

11. Quelques abréviations et noms de protéines impliquées dans l'épigénétique

Source : Wikipédia

• "writers" : histone acétyltransférases, histone méthyltransférases
• "erasers" : histone désacétylases, lysine déméthylases
• "readers" : chromodomaine, domaine Tudor et domaine PWWP - PHD Finger Domains - Bromodomains - ...

12. L'épitranscriptome : N6-méthyl-adénosine et autres nucléosides modifiés

Les nouvelles technologies de séquençage ont permis d'établir que la méthylation du transcriptome (épitranscriptome) est un processus quasi général au même titre que la méthylation du génome (épigénome).

L'immunoprécipitation des ARN méthylés, suivie d'une technique de séquençage à haut débit ("Methylated RNA immunoprecipitation followed by sequencing" - MeRIP-Seq) permet d'obtenir le profil de la N6-méthyl-adénosine (m⁶A) à l'échelle du transcriptome.

• L'ARN est fragmenté en fragments d'environ 100 nucléotides de long.
• Les ARN contenant m⁶A sont ensuite immuno-précipités avec des anticorps spécifiques de m⁶A (enrichissement en fragments d'ARN qui contiennent m⁶A).
• Les lectures ("reads") issues du séquençage sont localisées sur le génome et les pics m⁶A (environ 200 nucléotides) sont identifiés.
• Exemple : l'étude de l'épitranscriptome du cerveau de la souris a révélé 13.471 pics m⁶A dérivés de 4.654 gènes.

Les données actuelles de l'épitranscriptome permettent d'en décrire quelques caractéristiques :

Source : Meyer & Jaffrey (2014)

• La plupart des pics m⁶A sont situés aux environs du codon stop (la répartition est à peu près égale en amont et en aval de ce site).
• Un sous-ensemble des ARN messagers contient des résidus m⁶A dans leur région 5′ non traduite ("5′-UnTranslated Region" - 5'-UTR). En général, cette région est relativement courte : la densité de résidus m⁶A y est donc remarquablement élevée.
• Les pics m⁶A contiennent une forte proportion des motifs consensus GAC (prépondérant) et AAC.
• Cet enrichissement m⁶A dans ces deux régions est inhabituel par rapport aux autres éléments de régulation des ARN messagers (par exemple, les miRNA ou les protéines qui se fixent de manière préférentielle sur les régions 3'-UTR des ARN messagers). Cet enrichissement suggère des fonctions de régulation propres à la méthylation des ARN (régulation de l'épissage, de la traduction, ...).

Les longs ARN non codants sont aussi sujets à la méthylation m6A. Exemples : "Long ncRNAs X inactive specific transcript" (XIST) et "HOX transcript antisense RNA" (HOTAIR - voir ci-dessus).

Comme pour l'épigénome, il existe :

• des adénosine méthyltransférases ("writers"). Exemple : le complexe MIS constitué de Ime4 ("Inducer of meiosis 4"), Mum2 ("Muddled meiosis 2") et de Slz1 ("Sporulation-specific with a Leu zipper motif protein 1")
• des m⁶A-deméthylases ("erasers"). Exemple : ALKBH5 ("α-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homologue 5")
• des "m⁶A-binding proteins" ("readers"). Exemples : YTHDF2, YTFDF3 et HuR

Outre le développement relativement récent d'anticorps anti-m⁶A (1988), des techniques ont été développées pour l'étude de la méthylation m⁶A :

• "m⁶A-sensitive ligase reaction"
• "m⁶A-sensitive reverse transcription"
• SCARLET ("Site-specific cleavage and radioactive-labelling followed by ligation-assisted extraction and thin-layer chromatography") : Il s'agit d'une digestion par une nucléase puis radiomarquage combinée à la modification de la migration de m⁶A en chromatographie couche mince ("thin-layer chromatography").
• "PacBio sequencing" : nouvelle technologie de détection par fluorescence qui utilise des guides d'ondes en mode zéro ("zero-mode waveguides" - nanostructures) et permet d'étudier la modification de la cinétique d'incorporation de base nucléotidique.

Exemples de modifications d'autres nucléosides

Près de 200 modifications chimiques des molécules d'ARN sont recensées.

Deux technologies dominent actuellement le séquençage à lecture longue ("long-read sequencing technologies") :

• le séquençage en temps réel d'une seule molécule ("Single-Molecule Real-Time (SMRT) sequencing technologies", Pacific Biosciences)
• le séquençage avec des nanopores (Oxford Nanopore Technologies)

• La formation de la 5-méthylcytosine (m⁵C) est une modification épigénétique catalysée par l'ADN méthyltransférase. La 5-méthylcytosine est incorporée au nucléoside 5-méthylcytidine.
• La queuine est une base nucléotidique modifiée en première position ("wobble") de l'anticodon des ARN de transfert Asn, Asp, His et Tyr. Le nucléoside associé à la queuine est la queuosine.

RMBase : base de données qui regroupe les données de séquençage d'épitranscriptomes pour l'analyse des modifications post-transcriptionnelles des ARN.