1. Généralités

2. Le marquage des protéines à dégrader par l'ubiquitine

a. Structure de l'ubiquitine
b. Mécanisme du marquage par l'ubiquitine : l'ubiquitination (ou ubiquitinylation)
c. Mécanisme de reconnaissance sélective des protéines à marquer
d. Les enzymes E3 - "HECT-type E3 ubiquitin transferase"
e. Illustration : le complexe LUBAC
f. Devenir des protéines selon le type de marquage par l'ubiquitine (mono- et poly-ubiquitination greffée ou linéaire)

3. Les enzymes de désubiquitination

4. Le protéasome 26S

5. Le protéasome 20S

6. Le protéasome 19S

7. Autres activateurs du protéasome 20S

8. Les machineries protéolytiques de la famille [AAA / ATPase]

9. La protéase ATP-dépendante bactérienne ClpXP

10. Liens Internet et références bibliographiques

1. Généralités.

Les protéines sont constamment synthétisées et dégradées dans tous les types de cellules dans le but :

• D'éviter les risques d'accumulation de protéines défectueuses qui pertuberaient gravement le fonctionnement cellulaire. Ces protéines défectueuses résultent du changement d'un ou plusieurs acide(s) aminé(s) dans leur séquence, d'un mauvais repliement de leur séquence ou de dommages chimiques pendant leur fonctionnement au sein de la cellule (exemple : le stress oxydatif).

• D'assurer un recyclage des acides aminés.

Il existe 3 processus de protéolyse (l'hydrolyse des protéines).

a. Une hydrolyse non spécifique des protéines ou des peptides alimentaires en fragments peptidiques par des protéases (enzymes digestives). Il en existe plusieurs familles constituées d'un trés grand nombre d'enzymes :

Toutes les informations fonctionnelles (spécificité des substrats, inhibiteurs, séquences et autres) et structurales sont recensées dans les bases de données, par exemple : The MEROPS database.

b. Un système protéolytique dans le lysosome des Eucaryotes qui permet de recycler les protéines membranaires, les protéines extracellulaires et les protéines caractérisées par de trés longs temps de demi-vie.

c. Enfin, chez les Eucaryotes, les Archées et certaines bactéries, il existe un processus hautement sélectif et régulé qui se déroule dans le noyau et le cytoplasme et qui nécessite de l'énergie (hydrolyse de l'ATP) : il s'agit du système protéolytique ubiquitine-protéasome.

Ce système joue un rôle majeur dans la dégradation des protéines impliquées dans le cycle cellulaire, la prolifération, l'apoptose, le contrôle de la transcription, la transduction du signal et la régulation du métabolisme.

De nombreuses enzymes qui constituent des points de contrôle des voies métaboliques sont aussi des cibles d'une dégradation fréquente.

Il existe d'autres processus de protéolyse qui n'ont pas trait à la dégradation des protéines mais bien au contraire à leur maturation par modifications post-traductionnelles. Il s'agit du clivage, entre autre,

• de la méthionine N-terminale issue du codon d'initiation de la traduction
• du clivage du (pré)-pro-peptide dans le cas de certains précurseurs inactifs (exemple : les protéases synthétisées sous forme de zymogène)
• du clivage du peptide signal en position N-terminale de la chaîne polypeptidique

Les temps de demi-vie dans la cellule des protéines sont trés variables :

• Ornithine décarboxylase 11 min - tryptophane oxygénase 2 h - myosine 30 jours. Ces temps de demi-vie sont en général plus courts que celui des cellules où se trouvent ces protéines.
• Un contre-exemple est l'hémoglobine dont le temps de demi-vie (110 jours) est équivalent à celui des érythrocytes où on la trouve.

Ces règles ne sont pas absolues car de nombreux paramètres influent sur le temps de demi-vie (et le taux de synthèse - dégradation) des protéines et des macromolécules biologiques.

2. Le marquage des protéines par l'ubiquitine : l'ubiquitination (ou ubiquitinylation)

a. Structure de l'ubiquitine

Chez les Eucaryotes, le processus spécialisé de dégradation des protéines met en jeu l'ubiquitine, protéine de 76 acides aminés (8,6 kDa).

Source : Narasimhan et al. (2019)

Cette protéine est ainsi appelée du fait de son ubiquité chez tous les Eucaryotes et dans tous les compartiments cellulaires des Eucaryotes.

Le mécanisme complet dans lequel cette protéine est impliquée a été élucidé au début des années 80 par Aaron Ciechanover, Avram Hershko et Irwin Rose (Prix Nobel de Chimie en 2004).

L'ubiquitine mature contient en particulier 7 résidus lysine et la glycine 76 C-terminale qui jouent un rôle trés important :

MQIFVK₆TLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQK₆₃ESTLHLVLRLRGG₇₆

L'ubiquitine (code PDB : 1UBQ) est toujours synthétisée sous la forme d'un précurseur inactif avec une extension du côté C-terminal au delà de la glycine 76.

Visualisation de l'ubiquitine de Homo sapiens à une résolution de 1,8 Å (code 1UBQ).

Il existe des protéines appelées "Ubiquitin-like protein" (UBLs) qui marquent également des protéines impliquées dans diverses voies de transduction du signal :

• "Small Ubiquitin-related MOdifier" (SUMO) : la modification post traductionnelle s'appelle la sumoylation.
• ISG15 ("Interferon-induced 15 kDa protein") : la modification post traductionnelle s'appelle l'ISGylation.
• NEDD8 ("Neddylin") : NEDD8 a 60% d'acides aminés identiques à l'ubiquitine.

b. Mécanisme du marquage par l'ubiquitine

Les protéines marquées sont attachées covalamment à un grand nombre de molécules d'ubiquitine par un système multi-enzymatique qui inclut :

• L'E1 ubiquitin-activating enzyme (enzyme E1 - E.C. 6.2.1.45) : au moins 2 enzymes E1 ont été mises en évidence chez l'homme.
• L'E2 ubiquitin-conjugating enzyme (enzyme E2 - E.C. 2.3.2.23) : le génome des Mammifères code pour plus de 30 enzymes de conjugaison E2.
• L'HECT-type E3 ubiquitin transferase (enzyme E3 - E.C. 2.3.2.26) : il existe au moins 500 ligases E3 chez l'homme.

Le mécanisme du marquage de la séquence d'une protéine par l'ubiquitine ou ubiquitination est présenté dans la figure ci-dessous :

a. Le groupement carboxyle libre de la glycine 76 C-terminale (G₇₆) d'une molécule d'ubiquitine est activé par la cystéine (-SH) du site actif de l'enzyme E1, sous la forme d'une liaison thioester à haut potentiel énergétique. Cette étape requiert de l'énergie (hydrolyse de l'ATP).

b. Cette liaison thioester est ensuite transferée à une cystéine réactive de l'enzyme E2.

c. Finalement, le groupement carboxyle de G₇₆ de l'ubiquitine est lié via une liaison amide (isopeptidique) au groupement ε-aminé de la chaîne latérale d'un résidu lysine (K) de la protéine cible à dégrader. Cette étape est catalysée par l'enzyme E3.

d. Si la protéine est déstinée à être dégradée, ce processus est répété. En effet, il faut au moins 4 molécules d'ubiquitine avant que la protéine à dégrader soit dirigée vers le protéasome 26S pour y être trés rapidement hydrolysée en peptides de 3 à 24 acides aminés.

e. L'ubiquitine est relarguée avant l'hydrolyse et elle est recyclée.

Exemple de poly-ubiquitination

1 molécule d'ubiquitine est ajoutée à la protéine à dégrader via une liaison isopeptidique entre G₇₆ de l'ubiquitine et le groupement ε-aminé de la chaîne latérale d'un résidu lysine de la protéine à dégrader (figure ci-dessous).

Puis 3 molécules d'ubiquitine sont ajoutées via le même type de liaison entre G₇₆ de l'ubiquitine nouvellement ajoutée et K₄₈ de la molécule d'ubiquitine précédemment ajoutée.

Il peut cependant se former différents types de polymères de topologies variées (voir le devenir des chaînes marquées par l'ubiquitine).

c. Mécanisme de reconnaissance sélective des protéines à marquer

Ce mécanisme mobilise (figure ci-dessous) :

Source : Aaron Ciechanover (1998)

a. Au moins 2 enzymes E1 qui activent l'ubiquitine.

b. Au moins 30 enzymes E2 : chaque enzyme E1 transfère l'ubiquitine à plusieurs enzymes E2.

c. Au moins 500 enzymes E3 : dans la plupart des cas, les enzymes E2 transfèrent l'ubiquitine à plusieurs enzymes E3 (quelques rares transferts sont spécifiques d'une enzyme E3).

d. Enfin, les enzymes E3 :

• Reconnaissent de manière spécifique les protéines cibles à marquer
• ou reconnaissent des groupes de protéines similaires ayant des motifs structuraux communs.
• A l'inverse, certaines protéines cibles à marquer sont reconnues par plusieurs enzymes E3 via des motifs structuraux distincts.

e. Il est à noter que chez certains organismes, un "facteur E4" a été mis en évidence dans cette cascade de marquage.

d. Les enzymes E3 - "HECT-type E3 ubiquitin transferase"

Il existe 3 principaux groupes d'enzymes E3 chez les eukaryotes.

α. Le groupe qui contient un domaine structural appelé RING ("Really Interesting New Gene").

Source : Deshaies & Joazeiro (2009)

• Le domaine RING est caractérisé par un motif de type "zinc-finger" dont la séquence consensus est : C-x(2)-C-x(9,39)-C-x(1,3)-H-x(2,3)-C-x(2)-C-x(4,48)-C-x(2)-C où x est n'importe quel acide aminé.
• Les ubiquitine-transferases à domaine RING sont très conservées de la levure à l'homme.

β. Le groupe qui contient un domaine structural appelé HECT ("Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus").

γ. Le groupe qui a une architecture "RING-between-RING" (RBR). Ces enzymes E3 possèdent 2 domaines RING : l'un interagit avec une enzyme de conjuguaison E2 et l'autre possède l'activité ligase comme les enzymes E3 à domaine HECT.

Source : Rieser et al. (2013)

e. Illustration : le complexe LUBAC

LUBAC ("Linear Ubiquitin Chain Assembly Complex") est un complexe protéique à activité ubiquitine ligase E3 à domaine "RING-between-RING" qui synthètise des chaînes linéaires de poly-ubiquitines.

Le complexe LUBAC est un énorme complexe d'environ 600 kDa (figure ci-dessous).

Source : Carvajal et al. (2021)

Le complexe LUBAC est constitué de 3 protéines :

• HOIL-1 (ou HOIL-1L ou RBCK1) : "RanBP-type and C3HC4-type zinc finger-containing protein 1" (E.C. 2.3.2.31) est la sous-unité catalytique de ce complexe.
• HOIP (ou RNF31) : "E3 ubiquitin-protein ligase RNF31" (E.C. 2.3.2.31) est la partie centrale de l'architecture globale de LUBAC.
• SHARPIN (ou SIPL1) : "SHANK-associated RH domain interacting protein". La région C-terminale a une grande similarité de séquence la région N-terminale de HOIL-1. [SHANK : "SH3 and multiple ANKyrin repeat domain" / RH : "RBCK1 Homology"].

Le premier domaine NZF1 ("Nuclear protein localisation 4 (Npl4)-Zinc-Finger 1") de HOIP et chacun des domaines NZF de SHARPIN et HOIL-1 sont impliqués dans la fixation à l'ubiquitine.

Les autres domaines sont impliqués dans la formation du complexe LUBAC.

HOIP (partie centrale de LUBAC) se fixe à HOIL-1 et à SHARPIN. L'interaction [HOIP/HOIL-1] et [HOIP/SHARPIN] s'effectue via un domaine structural qui mime la structure de l'ubiquitine : le domaine "UBiquitin-Like" (UBL).

Source : Rieser et al. (2013) - UBA : "UBiquitin-Associated domain"

L'assemblage des chaînes linéaires de polyubiquitines par LUBAC a 2 caractéristiques :

• La liaison isopeptidique n'implique pas l'une des lysines de l'ubiquitine. C'est le groupement α-aminé de la méthionine N-terminale d'une molécule d'ubiquitine qui est liée à Gly C-terminale de la molécule d'ubiquitine suivante dans la chaîne. Ces chaînes sont appelées chaînes liées par M1 ("M1-linked chains").

• LUBAC a la capacité de déterminer le type de chaîne d'ubiquitines qui doit être formée, une activité qui est en principe dévolue aux enzymes de conjuguaison E2 ("E2 Ubiquitin-conjugating enzymes").

f. Devenir des protéines selon le type de marquage par l'ubiquitine (mono- et poly-ubiquitination greffée ou linéaire)

Les 7 lysines de l'ubiquitine peuvent être utilisées pour le marquage. Cette multiplicité de topologies des chaînes explique en partie la diversité de signaux médiées par le marquage par l'ubiquitine : certaines protéines sont destinées à la dégradation par le protéasome et d'autres protéines sont destinées à des voies de signalisation.

Le devenir du complexe [protéine marquée - molécules d'ubiquitine] dépend notamment :

• du nombre de monomères d'ubiquitine attachés
• de la configuration des liaisons entre les molécules d'ubiquitine : chaîne d'ubiquitines greffée ou linéaire

Protéines déstinées à la dégradation

Les chaînes constituées d'au moins 4 molécules d'ubiquitine où G₇₆ d'une molécule d'ubiquitine est attaché à K₄₈ de la molécule d'ubiquitine suivante (voir schéma plus haut) sont dirigées vers le protéasome 26S pour y être dégradées.

Protéines déstinées à des voies de signalisation

α. Les protéines mono-ubiquitinylées (fixation d'une molécule d'ubiquitine sur un résidu de la protéine à dégrader) ou multi-mono-ubiquitinylées (fixation d'une molécule d'ubiquitine sur plusieurs résidus de la protéine à dégrader) ne sont pas destinées à la dégradation par le protéasome 26S. Exemples :

• traffic membranaire
• modifications des histones H2A : inactivation du chromosome X
• modifications des histones H2B : régulation de la transcription

β. Les protéines sur lesquelles s'est fixée une courte chaîne de molécules d'ubiquitine liées entre elles par K₆ ou par K₆₃ ne sont pas destinées à la dégradation par le protéasome 26S. Exemples :

• réparation de l'ADN
• réponse inflammatoire
• signalisation cellulaire (transduction du signal via l'activation de kinases)

γ. Illustration de 2 voies d'activation du facteur NF-κB ("Nuclear Factor-κB")

NF-κB est un facteur de transcription activé par de nombreux stimuli tels que les infections virales ou fongiques, les agents pathogènes bactériens, les cytokines proinflammatoires, les agents génotoxiques, les rayons ultraviolet ou le stress oxidatif.

La voie classique (figure ci-dessous) est activée par des cytokines inflammatoires comme TNF-α : le résultat est l'activation du complexe IKK (IKKα, IKKβ et NEMO).

Le complexe IKK phosphoryle IκBα, entraînant son marquage par l'ubiquitine et sa dégradation par le protéasome : NF-κB est ainsi libéré. NF-κB est constitué de p50 et p65 qui sont transloqués dans le noyau où ils activent la transcription de nombreux gènes.

Source : Tokunaga & Iwai (2012)

La voie non-classique implique l'activation du dimère IKKα qui phosphoryle p100. p100 est alors maturé en p52 par la voie [ubiquitine / protéasome]. Le facteur NF-κB activé par cette voie non-classique est constitué de p52 et RelB qui sont également transloqués dans le noyau.

3. Les enzymes de désubiquitination

Il existe des dizaines d'enzymes qui catalysent la désubiquitination ("DeUBiquitinating enzymes" - DUB).

On recence au moins six groupes de DUB : Ubiquitin C-terminal hydrolases (UCH); Ubiquitin-specific processing proteases (UBP or USP); Jab1/Pad1/MPN-domain-containing metallo enzymes (JAMM); Otu-domain ubiquitin-aldehyde-binding proteins (exemple : Ubiquitin thioesterase OTUB1); Ataxin-3/Josephin; ubiquitin-like proteases (ULP).

Ce sont d'importants régulateurs du système ubiquitine - protéasome.

Ces enzymes :

• Activent les précurseurs d'ubiquitine.
• Vérifient les complexes [protéine à dégrader - molécules d'ubiquitine] (activité "proofreading") en enlevant les molécules d'ubiquitine et en vérifiant que la protéine est bien destinée à être dégradée.
• Débarrassent le protéasome 26S (voir ci-dessous) de toute chaîne de (poly)ubiquitine qui inhiberait le processus de dégradation. En effet, ces molécules "libres" d'ubiquitine seraient en compétition pour les sites de fixation de l'ubiquitine avec les complexes entrant [protéine à dégrader - molécules d'ubiquitine].

Voir un cours sur les pseudoenzymes.

4. Le protéasome 26S

Les protéasomes sont des complexes protéiques que l'on trouve chez tous les Eucaryotes et les Archées et chez certaines bactéries. Chez les Eucaryotes, les protéasomes sont situés dans le noyau et dans le cytoplasme.

Le protéasome 26S est la forme la plus fréquente du protéasome. Le protéasome 26S est un énorme complexe multi-enzymatique constitué de nombreuses sous-unités : il résulte de l'assemblage du protéasome 20S et du protéasome 19S qui met en jeu de l'énergie via l'hydrolyse de l'ATP.

Source : Julian Adams (2004)

Le protéasome 26S est tellement volumineux (environ 3000 kDa) qu'il s'apparente davantage à une particule qu'à une molécule. C'est la raison pour laquelle on le désigne par le symbole "S" ou Svedberg, l'unité du coefficient de sédimentation.

Ci-dessous, schéma des 3 principaux modes d'hydrolyse coordonnée de l'ATP et description de la manière dont ils régulent le cycle complet du traitement du substrat par la forme holoenzyme du protéasome.

Source : Dong et al. (2019)

L'holoenzyme est assemblée à partir :

• D'une particule centrale 20S (CP) en forme de tonneau qui possède l'activité protéolytique
• Et de deux particules régulatrices 19S (RP) coiffant les deux extrémités du cylindre CP

La reconnaissance des substrats ubiquitinylés est assurée par les récepteurs de l'ubiquitine RPN1, RPN10 et RPN13.

Lorsqu'une protéine substrat est fixée au RP, les domaines globulaires de cette protéine substrat sont dépliés par un "moteur ATP" hétérohexamérique :

• Ce module moteur se compose de 6 sous-unités distinctes (RPT1 – RPT6) de la famille AAA+ (voir ci-dessous)
• Il régule l'engagement, la désubiquitination catalysée par la RPN11 et la dégradation ATP-dépendante des substrats.

5. Le protéasome 20S

Le protéasome 20S est le coeur protéolytique du protéasome 26S (figure ci-dessous).

• Le protéasome 20S est composé de 28 sous-unités arrangées en 4 anneaux heptamériques empilés (α₇, β₇, β'₇, α'₇) et l'ensemble adopte une structure cylindrique.
• Le protéasome 20S est pourvu de multiples activités peptidases et constitue la machinerie catalytique.
• Sa forme fermée en tonneau délimite une cavité interne constituée de 3 compartiments : ils contiennent les sites actifs qui hydrolysent les liaisons peptidiques des protéines à dégrader (activité protéolytique).
• Structure PDB 3SDK.

Source : Groll et al. (1997)

Ces sites actifs sont donc confinés à l'intérieur du protéasome 20S et isolés de l'environnement cellulaire. Ainsi, les protéines de la cellule qui ne doivent pas être dégradées sont protégées d'une dégradation inopportune.

L'accès des protéines à dégrader au site actif de ce complexe est sous le contrôle des sous-unités α qui ne permettent l'accès qu'aux polypeptides qui ont été préalablement dépliés (voir le protéasome 19S).

Les sous-unités β1, β2 et β5 possèdent l'activité protéolytique et elles hydrolysent la liaison peptidique de manières spécifiques :

• après des résidus acides dans le cas de β1 : spécificité identique à la caspase - Glu, Asp en position P1 de la liaison peptidique hydrolysée
• après des résidus basiques dans le cas de β2 : spécificité identique à la trypsine - Arg ou Lys en position P1
• après des résidus hydrophobes dans le cas de β5 : spécificité identique à la chymotrypsine - Tyr ou Phe en position P1

Les sous-unités β1, β2 et β5 sont synthétisées sous forme de précurseurs activés après protéolyse d'un peptide N-terminal. Ces hydrolases constituent une famille unique de protéase à thréonine.

Les sous-unités β3, β4, β6 et β7 n'ont pas d'activité protéolytique.

6. Le protéasome 19S

Le protéasome 19S est aussi appelé PA700 ("Proteasome Activator MW 700") ou "regulatory complex". Il forme une coiffe à une ou aux deux extrémité(s) du protéasome 20S.

Source : Murata et al. (2009)

• C'est un complexe constitué d'au moins 19 sous-unités différentes (700 kDa), dont 6 sous-unités qui ont une activité ATPasique (hydrolyse de l'ATP).
• Les sous-unités ATPasiques ont un domaine de fixation de l'ATP d'environ 250 à 300 acides aminés.
• Ces 6 sous-unités forment un anneau hexamérique qui interagit avec le protéasome 20S.

Les rôles du protéasome 19S sont :

Source : Sullivan et al. (2003)

1. La reconnaissance et la fixation de la protéine qui doit être dégradée.

2. L'élimination des molécules d'ubiquitine (qui sont recyclées) par les sous-unités isopeptidases. Il existe deux classes d'isopeptidases : les "Ubiquitin C-terminal Hydrolases" (UCH) et les "UBiquitin-specific Proteases" (UBP).

3. Le dépliement de la chaîne polypeptidique de la protéine qui doit être dégradée car le diamètre (1 nm) du "conduit d'entrée" au protéasome 20S et le diamètre de la cavité interne (5 nm) ne permettent pas au protéasome 20S d'encapsuler des protéines repliées : les 6 sous-unités ATPases du protéasome 19S catalysent le dépliement grâce à l'énergie produite par l'hydrolyse de l'ATP.

4. L'activation du protéasome : ces ATPases sont également responsables de l'ouverture de la "barrière" qui ferme l'entrée du protéasome 20S et de l'injection des protéines dépliées dans la cavité protéolytique. Pour ce dernier rôle, le protéasome 19S est aussi appelé "Proteasome Activator" (ou PA700).

7. Autres activateurs du protéasome 20S

Il existe d'autre formes qui activent le protéasome 20S mais qui ne fixent pas les protéines ubiquitinylées :

• Le protéasome 11S ou PA28 (PA26 chez Trypanosoma brucei) constitué de 7 sous-unités identiques ou non de 28 kDa.
• Le protéasome PA200 constitué d'une seule chaîne polypeptidique de 200 kDa.

8. Les machineries protéolytiques de la famille [AAA / ATPase]

La famille AAA maintenant appelée AAA+ (ATPases Associées à diverses Activités cellulaires - "ATPases Associated with diverse cellular Activities" - Kunau et al., 1993) est un groupe important d'ATPases présentes dans tous les règnes du vivant.

• La famille AAA+ est inclue dans la superfamille des NTPases (NTP : nucléosides triphosphates) à boucle P en forme d'anneau (certaines ne possédant pas le domaine SRH).
• Interpro : "P-loop containing nucleoside triphosphate hydrolase" - IPR027417
• PFAM : Family AAA (PF00004)

Il y a six clades majeurs dans la famille des protéines à domaines AAA+ : les sous-unités du protéasome, des métalloprotéases, les domaines D1 et D2 des ATPases à 2 domaines AAA, le groupe [MSP1 / katanine / spastine] et BCS1 et ses homologues.

Exemples de rôles biologiques des protéines [AAA / ATPases]

• Dans tous les organismes, les protéines [AAA / ATPases] sont impliquées dans les processus de dégradation des protéines et de réplication de l'ADN.
• L'activité de dépliement de la chaîne polypeptidique qui se déroule dans les machineries AAA+ peut également être utilisée pour remodeler les complexes macromoléculaires et re-solubiliser les agrégats protéiques ou de polynucléotides.
• Chez les Eucaryotes, les protéines [AAA / ATPases] participent aussi à la biogénèse des peroxisomes, la transduction du signal et la régulation de la transcription des gènes.
• Les dynéines constituent l'une des 3 principales classes de protéines motrices : ce sont des protéines AAA+ qui couplent leur activité ATPase à un mouvement moléculaire le long des microtubules.
• Chez les bactéries, les champignons et les plantes, les protéines [AAA / ATPases] sont impliquées dans la thermo-tolérance.
• L'AAA-ATPase NSF ("N-ethylmaleimide-Sensitive Factor") est impliquée dans le désassemblage des complexes SNARE responsable de la fusion des membranes lors du tafic vésiculaire.
• Les protéines AAA+ p97 (aussi appelées Cdc48) sont parmi les mieux étudiées.

Les protéines sécrétées mal repliées sont exportées depuis le réticulum endoplasmique (RE) puis dégradées par la voie de dégradation associée au RE (voie ERAD).

Source : Eisele et al. (2010)

Les protéines membranaires ou luminales non fonctionnelles sont extraites du RE puis dégradées dans le cytosol par les protéasomes. L'extraction et la rétro-translocation de ces protéines est assistée par le complexe [Cdc48p(Ufd1p/Npl4p)] du côté cytosolique de la membrane.

Une fois dans le cytosol, ces protéines sont ubiquitinylées avant dégradation par le protéasome 26S.

Les machineries protéolytiques de la famille AAA+ (ClpXP, ClpAP, ClpCP, HslUV, Lon, FtsH, PAN/20 et le protéasome 26S) assurent un contrôle qualité des protéines et sont des circuits de régulation de toutes les cellules.

Mécanisme de base d'une protéine [AAA / ATPase]

Les machineries protéolytiques de la famille AAA+ sont constituées :

• d'un compartiment qui contient des protéases, compartiment où leurs sites actifs sont séquestrés dans une chambre intérieure
• d'un anneau hexamérique d'ATPases AAA+

Source : Sauer & Baker (2011)

• Une étiquette de dégradation (appelé "degron") sur une chaîne polypeptidique est reconnue par l'hexamére AAA+ de dépliement ("unfoldase").
• Les substrats protéiques sont attachés à l'anneau, soit directement soit par l'intermédiaire de protéines adaptatrices.
• Une région non structurée de la chaîne polypeptidique du substrat protéique est engagée dans le pore axial de l'anneau AAA+ et plusieurs cycles de [fixation / hydrolyse] de l'ATP induisent des changements conformationnels qui créent des impulsions de traction.
• La chaîne polypeptidique est dénaturée et ces tractions déplacent le polypeptide déplié au travers du pore dans la chambre de dégradation par les peptidases associées.

Structures quaternaires des protéines [AAA/ATPases]

Les ATPases de la famille AAA+ sont caractérisées par 1 ou 2 domaine(s) conservé(s) de fixation de l'ATP d'un type appelé motif AAA.

Le domaine AAA+ contient 2 sous-domaines :

• Un sous-domaine [α/β] N-terminal qui fixe (via un pli Rossman) et hydrolyse des nucléotides. Ce sous-domaine (200 à 250 acides aminés) contient lui-même :
  • Des motifs Walker A (boucle de fixation du phosphate) et Walker B (site de fixation du Mg²⁺).
  • Un sous-domaine SRH ("Second Region of Homology") situé en position C-terminale du motif Walker B. Ce domaine est commun aux membres de la super famille des NTPases à boucle P.
• Un sous-domaine C-terminal riche en hélice α.

Figure ci-dessous: éléments de structure secondaire conservés. Motif Walker A ([AG]-x(4)-G-K-[ST]), boucle de pore 1, motif Walker B (hhhhDE avec h = acide aminé hydrophobe, D est important pour la coordination du Mg²⁺ et E sert de base catalytique), capteur 1 ("sensor 1") et les doigts Arg (RR) dans la deuxième région d'homologie.

Source : Puchades et al. (2019)

• La plupart des protéines AAA+ possèdent des domaines supplémentaires utilisés pour l'oligomérisation, la fixation du substrat ou la régulation.
• Certaines classes de protéines AAA+ ont un domaine N-terminal non ATPase suivi par 1 ou 2 domaine(s) AAA (D1 et D2 - exemple : Cdc48/p97).
• Plus précisément, du point de vue phylogénétique, les protéines AAA+ appartiennent à la sous-classe appelée "Additional Strand, Catalytic E (ASCE) subclass of "P-loop"-type NTPases (nucleotide triphosphate-binding proteins)".

Figure ci-dessous : structures des domaines des sous-unités qui forment les sous-familles de protéases FtsH, Lon (sous-familles de LonA et LonB), HslUV, ClpXP, ClpAP, ClpCP et [PAN ("Proteasome-Activating Nucleotidase") / 20S].

Source : Sauer & Baker (2011)

• Chaque sous-famille contient au moins un "module AAA+" qui se compose d'un petit et d'un grand domaines AAA+ (ClpA et ClpC contiennent 2 "modules AAA+").
• Les domaines à activité protéase sont liés au "module AAA+" de Lon et de FtsH mais constituent des complexes oligomèriques distincts pour les autres sous-familles.
• Chaque groupe de protéases AAA+ contient au moins un domaine auxiliaire spécifique de sa sous-famille, qui sert souvent de site d'ancrage du substrat protéique ou d'adaptateur.

9. La protéase ATP-dépendante bactérienne ClpXP

Le protéasome 26S est la seule protéase ATP-dépendante soluble dans le cytosol chez les Eucaryotes.

En revanche, les bactéries possèdent plusieurs protéases ATP-dépendantes comme ClpXP, HslUV et les eubactéries possèdent le système [protéasome - ARC / Mpa] ("AAA ATPase forming Ring-shaped Complexes / Mycobacterial proteasomal ATPase").

Figure ci-dessous : comparaison de différentes classes de protéases ATP-dépendantes.

• (A) Le protéasome 26S des Eucaryotes composé du protéasome 20S flanquée des sous-unités régulatrices du protéasome 19S.
• (B) La protéase bactérienne ClpXP, composée de la protéase ClpP (anneaux en vert foncé, figure ci-dessous) et du moteur [AAA+ / ATPase] ClpX (en rouge). ClpX reconnaît le signal de dégradation (exemple : la séquence peptidique ssrA en vert clair) qui sert également de site pour l'initiation de la dégradation.
• (C) Le protéasome actino-bactérien, composé d'une particule noyau 20S semblable à celle du protéasome 26S et d'un seul anneau ATPase Mpa (en violet).

Source : Kraut & Matouschek (2010)

Mpa ("Proteasome-associated ATPase") se fixe à la chaîne polypeptidique substrat via une modification covalente : la pupylation ("PUP" en vert clair).

• La protéine PUP ("Prokaryotic Ubiquitin-like Protein") contient une région N-terminale non structurée qui sert de site d'initiation de la dégradation.
• La pupylation est une modification post-traductionnelle : la Gln C-terminale de certaines protéines (intrinsèquement non structurée) de procaryotes ressemblant à l'ubiquitine est désamidée en Glu puis fixée aux protéines destinées à la dégradation.

La protéase ClpXP de Escherichia coli dégrade les protéines portant l'étiquette ssrA qui possède la séquence AANDENYALAA-COOH :

• Le dipeptide C-terminal et le groupement carboxyle sont reconnus par le pore ClpX, tandis que les résidus N-terminaux de cette séquence se fixent à SspB, une protéine adaptatrice qui lie également ClpX.
• Les contacts "degron-pore", "degron-adaptateur" et "adaptateur-protéase" contribuent tous à la reconnaissance de ClpXP et à la dégradation des protéines portant l'étiquette ssrA.

Source : McGinness et al. (2006)