1. Préambule

2. L'hexokinase et la glucokinase

3. La phosphofructokinase-1 (PFK-1)

4. La pyruvate kinase

5. La phosphofructokinase-2

6. La charge énergétique adénylique

7. Rôle de l'insuline

8. Liens Internet et références bibliographiques

1. Préambule

La glycolyse produit de l'énergie rapidement mais sur de courtes durées. La régulation de la glycolyse est liée aux besoins énergétiques de la cellule.

Les sites de régulation de la glycolyse correspondent aux 3 étapes irréversibles de cette voie métabolique. Ce sont les réactions catalysées par des enzymes à régulation allostérique.

La modulation de l'activité de ces enzymes est un moyen de contrôler le flux global de la glycolyse.

2. L'hexokinase et la glucokinase

L'hexokinase (E.C. 2.7.1.1) est inhibée par le produit de la réaction qu'elle catalyse : le glucose-6-phosphate. Cette inhibition se fait de deux manières :

• par inhibition compétitive au niveau du site actif
• par effet allostérique au niveau d'un site effecteur

La régulation de l'hexokinase n'est pas un point de contrôle majeur du flux de la glycolyse car une grande partie du glucose-6-phosphate provient de l'hydrolyse du glycogène (glycogène --> glucose 1-phosphate) puis isomérisation en glucose 6-phosphate par la phosphoglucomutase. En conséquence la réaction catalysée par l'hexokinase peut être contournée.

La glucokinase (E.C. 2.7.1.2) est l'isoforme IV de l'hexokinase (mammifères) que l'on trouve dans le foie. Elle a un K_M élevé pour le glucose et n'est donc active qu'à fortes concentrations de glucose (figure ci-dessous) :

K_M^glucokinase = 10 mM - K_M^hexokinase = 0.1 mM - [glucose sanguin] = 5 mM

Le K_M élevé de la glucokinase pour le glucose permet que le foie stocke celui-ci sous forme de glycogène quand le taux de glucose sanguin est élevé.

A l'inverse la glucose-6-phosphatase du foie (enzyme de la néoglucogénèse - E.C. 3.1.3.9) catalyse l'hydrolyse du glucose-6-phosphate et le glucose est relargué dans le sang ce qui maintient sa concentration circulante. En conséquence, la glucokinase et la glucose-6-phosphatase, que l'on ne trouve quasi exclusivement que dans le foie, permettent à celui-ci de contrôler le taux de glucose sanguin.

• La glucokinase n'est pas inhibée par le glucose-6-phosphate.
• La glucokinase est inhibée par une protéine de régulation : la "glucokinase regulatory protein" (GKRP), avec laquelle elle forme un complexe.
• La transcription du gène codant la glucokinase est activé par l'insuline.
• Il a été montré que la glucokinase possède un motif de fixation de la phosphofructokinase-2 / fructose 2,6-bisphosphatase [PFK-2 / FBPase-2]. Ce motif (SLKVWT) correspond au domaine phosphatase de la [PFK-2 / FBPase-2]. Cette interaction stabilise la forme active de la glucokinase (Baltrusch & Tiedge, 2006).

3. La phosphofructokinase-1 (PFK-1)

Elle joue un rôle primordial dans la régulation du flux de la glycolyse.

En effet, l'activité de cette enzyme est régulée par la concentration de ces substrats (l'ATP et le fructose 6-phosphate) mais aussi par celles de nombreux effecteurs liés à la production d'énergie par la phosphorylation oxydative.

Ces effecteurs sont : l'ATP lui-même (voir ci-après) / l'ADP / l'AMP / le phosphoénolpyruvate / le phosphate inorganique / le citrate / le NADH

L'ATP est un cas particulier car c'est l'un des deux substrats de la PFK-1 mais c'est aussi un effecteur, puisque la PFK-1 possède :

• un site de fixation de l'ATP en tant que substrat (effet homotrope)
• un site de fixation en tant qu'effecteur (effet hétérotrope)

1. Partie gauche de la courbe de saturation ci-dessous

Elle traduit l'effet de l'ATP sur la vitesse de la réaction enzymatique en tant que substrat.

L'allure hyperbolique de cette première partie de la courbe indique que la fixation de l'ATP aux 4 sites catalytiques (la PFK-1 est un homotétramère) s'effectue selon un mécanisme "Michaelien" (voir le cours). Celà signifie qu'il n'y a pas d'effet coopératif dans la fixation des molécules d'ATP.

2. Partie droite de la courbe de saturation

A partir d'une certaine concentration, des molécules d'ATP se fixent aussi sur un site qui n'est pas le site catalytique : ce site régule l'activité catalytique.

C'est un site effecteur :

• la fixation de molécules d'ATP sur ce site induit un changement de conformation de certaines molécules d'enzyme.
• les sites catalytiques dans cette conformation (dite "tendue" ou "tense", T) ne fixe pas ou trés mal l'ATP.
• dans cette conformation T, l'enzyme n'est pas ou trés peu active.

3. En conséquence : une partie des molécules d'enzyme étant inactive, la concentration réelle de complexe enzyme - substrat ([ES]) est moindre que la concentration d'enzyme.

La vitesse de catalyse diminue puisque : v_i = k_cat x [ES].

4. La pyruvate kinase (E.C. 2.7.1.40)

Elle est activée par le fructose 1,6-bisphosphate. Or ce métabolite se situe en amont de la réaction catalysée par la pyruvate kinase : on appelle ce phénomène "feed - forward".

En revanche la pyruvate kinase est inhibée par l'ATP.

La réaction catalysée par la pyruvate kinase est controlée dans le foie en partie par la modulation de la quantité d'enzyme synthétisée. C'est le cas d'un très grand nombre d'enzymes qui contrôlent le flux d'une voie métabolique.

La transcription du gène codant la pyruvate kinase est sous le contrôle d'un facteur de transcription : "Carbohydrate Responsive Element Binding Protein" - ChREBP.

Source : Biocarta

• la phosphorylation de Ser 196 inactive l'importation de ChREBP dans le noyau
• la phosphorylation de Thr 666 empêche la fixation de ChREBP sur l'ADN

De fortes concentrations de glucose activent la protéine phosphatase 2A xylulose-5-phosphate-dépendante (PP2A) qui déphosphoryle Ser 196 ce qui entraîne la délocalisation ChREBP dans le noyau.

Dans le noyau, PP2A déphosphoryle Thr 666 de ChREBP, ce qui entraîne l'activation de la transcription du gène codant la pyruvate kinase.

L'excès de glucose est alors converti en pyruvate puis en acétyl-CoA, le principal précurseur de la synthèse des acides gras, qui est la forme de stockage de l'énergie à long terme.

5. La phosphofructokinase-2 (E.C. 2.7.1.105)

Le fructose 2,6-bisphosphate (F2,6BP) est formé à partir du fructose 6-phosphate par la phosphofructokinase-2 ou PFK-2. La PFK-2 est un homodimère d'environ 100.000 daltons.

Le F2,6BP est un puissant activateur de la PFK-1 (sauf chez certains protistes pour lesquels il est activateur de la pyruvate kinase).

Dans le foie, le F2,6BP est un inhibiteur de la fructose-1,6-bisphosphatase, une enzyme de la néoglucogénèse.

Le citrate est un inhibiteur de la PFK-2 : il y a moins de F2,6BP synthétisé. Or le F2,6BP étant un activateur de la PFK-1, celà amplifie l'inhibition de la PFK-1 par le citrate.

Dans les cellules humaines, le citrate cytosolique est un précurseur capital pour la synthèse des acides gras, des triacyl-glycérols, du cholestérol et des lipoprotéines de faible densité ("low-density lipoprotein").

De plus, le citrate cytosolique régule la balance énergétique de la cellule en activant la synthèse des acides gras et en ralentissant la glycolyse et la β-oxidation des acides gras.

La vitesse de synthèse des acides gras dans le foie et les cellules adipeuses (les 2 principaux tissus pour cette synthèse) est directement corrélée à la concentration du citrate dans le cytosol. Cette concentration dépend partiellement de l'import du citrate au travers de la membrane plasmique via le transporteur Na+-citrate.

Régulation de la PFK-2 par le glucagon

Dans le foie, la PFK-2 est sous le contrôle du glucagon, une hormone produite par le pancréas quand le taux de glucose sanguin s'abaisse.

Quand la concentration du glucagon augmente, la protéine kinase AMP cyclique dépendante (PKA) phosphoryle une sérine ou une thréonine de la [PFK-2 / FBPase-2] (exemples : foie de rat : S32 - coeur de boeuf : S84 - levure : T157).

Source : Okar et al. (2001) - K/B : rapport des activités [PFK-2/FBPase-2] - HGP : production du glucose par le foie

La déphosphorylation est catalysée par la protéine phosphatase 2A xylulose-5-phosphate-dépendante (PP2A) qui est activée par le glucose (voir ci-dessus).

La phosphorylation :

• réduit son activité kinase (il y a moins de synthèse du F2,6BP)
• augmente son activité phosphatase

Conséquences :

• baisse de la concentration du F2,6BP
• la PFK-1 est moins activée
• la glycolyse est ralentie

6. La charge énergétique adénylique (Atkinson, DE, 1968)

La charge énergétique adénylique (CEA) de la cellule est définie par la relation :

 [ATP] + 1/2 [ADP]
---------------------
[ATP] + [ADP] + [AMP]

Cette relation exprime la fraction molaire en ATP (qui contient 2 liaisons phosphoanhydride à haut potentiel énergétique) plus la moitié de la fraction molaire en ADP (qui n'en contient qu'une).

La CEA est donc un senseur énergétique de la cellule qui lui permet de mesurer l'énergie dont elle dispose à un instant donné. Il s'agit d'un paramètre de valeur universelle atteignant des valeurs comparables chez tous les organismes vivants.

La CEA est très sensible aux variations de l'environnement interne des organismes ou de l'environnement extérieur : plus un organisme subit l'effet d'un stress, plus il consomme d'ATP pour contre-balancer ces effets, plus la CEA de cet organisme baisse.

En théorie, la valeur de la CEA peut varier de 0 (il n'y a que de l'AMP) à 1 (il n'y a que de l'ATP).

Cependant, dans la plupart des cellules, la CEA est trés finement régulée et on observe des variations de 0,7 (forte hydrolyse de l'ATP et de l'ADP en AMP) à 0,95 (typiquement une cellule au repos).

• Quand la valeur de la CEA est élevée, l'énergie que contient la cellule est suffisante : la glycolyse est ralentie.
• Quand la valeur est basse, la cellule a besoin d'énergie : la glycolyse est activée.

7. Rôle de l'insuline

La mobilisation du glucose par les muscles squelettiques représente environ 70% du glucose prélevé au sérum. Ce processus est donc extrêmement important dans l'homéostasie du glucose.

La contraction et l'insuline sont les stimuli majeurs qui activent le transport du glucose dans les muscles squelettiques.

Dans une cellule non stimulée ou quand la concentration en insuline est faible, le transporteur insulino-dépendant du glucose GLUT4 ("glucose transporter 4" - gène : SLC2A4) est localisé dans des vésicules de stockage des cellules hépatiques et musculaires.

Quand le niveau de glucose circulant est élevé, l'insuline est libérée par les ilots de Langerhans et elle augmente la mobilisation du glucose via une augmentation :

• de la synthèse du transporteur insulino-indépendant du glucose GLUT4 ("glucose transporter 4")
• de la translocation de ce transporteur des compartiments endosomiques vers la membrane plasmique

L'absorption du glucose augmente : le glucose pénètre davantage dans le muscle et le tissu adipeux par l'intermédiaire de ce type de transporteur.

Maturation de l'insuline

L'insuline est synthétisée dans les cellules β des îlots de Langerhans sous la forme d'un précurseur : la pré-pro-insuline.

• Le peptide signal est clivé dans le réticulum endoplasmique.
• Deux ponts disulfure inter-chaînes de l'insuline se forment dès la biosynthèse de la pro-insuline.
• La chaîne C de la pro-insuline a pour rôle de positionner correctement les chaînes A et B.
• Quand la pro-insuline est correctement repliée, le peptide C est éliminé et un pont disulfure intra-chaîne se forme.

L'insuline adopte sa forme fonctionnelle. Cette maturation par l'élimination du peptide C retarde l'apparition de l'activité hormonale de l'insuline jusqu'à ce qu'elle soit empaquetée dans les granules de sécrétion.

• effet de l'insuline sur la glycolyse : elle active la glucokinase, la PFK-1 et la pyruvate kinase.
• effet de l'insuline sur la glycogénogénèse : elle active la glycogène synthétase et inhibe l'activité phosphorylase.
• effet de l'insuline sur la néoglucogénèse : elle stimule la synthèse protéique diminuant ainsi la quantité d'acides aminés disponibles pour la néoglucogénèse.

L'effet net est une augmentation du stock de glycogène (foie) et une diminution de la production de glucose (muscle, tissu adipeux, foie).

Une carence en insuline (diabète insulino dépendant) a donc pour conséquence une élévation de la concentration du glucose sanguin.

Visualisation de l'insuline de porc à une résolution de 1,5 Å

Code PDB : 4INS

Les 4 chaînes (2 fois A et 2 fois B - dimère de dimère) sont colorées.

Schéma général simplifié de l'homéostasie du glucose et du métabolisme énergétique

N'est pas représenté le rôle de la protéine kinase activée par l'AMP ("5'-AMP-activated protein kinase") ou AMPK.