L'insuline est synthétisée sous la forme d'un précurseur, la pré-pro-insuline dans les cellules β des îlots de Langerhans.

• Le peptide signal est clivé dans le réticulum endoplasmique.
• Après synthèse, la partie centrale (le polypeptide C) est hydrolysée, ce qui génère les polypeptides A et B. L'insuline mature est constituée de ces 2 polypeptides A et B reliés par des pont disulfure.
• La réduction de l'insuline suivie de sa ré-oxydation s'accompagne d'une perte d'activité de 93%. Ceci est le résultat de la formation aléatoire des ponts disulfure.

Comment ces données sont-elles en accord avec l'idée que la séquence primaire d'une protéine dicte son repliement ?

1. Maturation de l'insuline

Deux ponts disulfure INTER-chaînes de l'insuline se forment dès la biosynthèse de la pro-insuline. La chaîne C de la pro-insuline a pour rôle de positionner correctement les chaînes A et B. Quand la pro-insuline est correctement repliée, le peptide C est éliminé et un pont disulfure INTRA-chaîne se forme.

L'insuline adopte alors sa forme fonctionnelle.

Cette maturation par l'élimination du peptide C retarde l'apparition de l'activité hormonale de l'insuline jusqu'à ce qu'elle soit empaquetée dans les granules de sécrétion.

Pont INTRA-chaîne : CYS A 6 - CYS A 11 - Ponts INTER-chaînes : CYS A 7- CYS B 7 / CYS A 20- CYS B 19

Visualisation de l'insuline de porc à une résolution de 1,5 Å

Code PDB : 4INS

Les 4 chaînes (A, B, C et D) sont colorées.

2. La cystéine et la méthionine

La cystéine (C ou Cys ou acide L-2-amino-3-mercaptopropionique) est codée par les 2 codons UGU et UGC. Sa chaîne latérale porte un groupement sulfhydryle (-SH) extrêmement réactif dont le pKa = 8.33.

L'autre acide aminé sulfuré, la méthionine (M ou Met) , porte un groupe méthyle supplémentaire. La méthionine est plus hydrophobe, d'un encombrement stérique plus important et moins réactive.

• Voir le cours sur la synthèse de la cystéine.
• Voir la voie métabolique : KEGG

3. Formation d'un pont disulfure

a. Introduction

Un pont disulfure est une liaison covalente entre 2 atomes de soufre de la chaîne latérale de 2 résidus cystéines (Cys) réduits.

Les ponts disulfures sont formés dans un environnement cellulaire oxydant. Le cytoplasme n'étant pas un milieu oxydant, il y a trés peu de protéines intracellulaires qui possèdent des ponts disulfures.

Toutes les cystéines d'une protéine ne forment pas un pont disulfure :

• Si l'on examine le fichier PDB-select 25, on s'aperçoit que seulement 27% des protéines contiennent des ponts disulfures.
• Par ailleurs, on ne connait pas les règles qui régissent la sélection de telle ou telle cystéine d'une protéine pour établir un pont disulfure.

Un pont disulfure peut être établi entre 2 cystéines :

• D'une même chaîne polypeptidique : on parle de pont inTRA - chaîne.
• Appartenant à 2 chaînes polypeptidiques (identiques ou différentes) : on parle de pont inTER - chaînes.

Le nombre de ponts disulfures (intra et/ou inter) au sein des protéines varie trés grandement : les toxines, bien qu'étant de petites protéines (20 à 30 acides aminés) peuvent en contenir jusqu'à 5, voire 6.

L'énergie libre de Gibbs de liaison qui résulte de la formation d'un pont disulfure est d'environ - 3,5 kcal/mol (voir Czaplewski et al., 2004). C'est une énergie importante qui contribue, théoriquement, de manière trés significative à la stabilisation de la structure tridimentionnelle native de la protéine.

Cependant, les ponts disulfures ne jouent pas un rôle déterminant dans le repliement des protéines, puisque les intermédiaires adoptent des conformations transitoires qui peuvent être éloignées de celles qui mettent en jeu ces ponts disulfures.

b. Nombre de ponts

Exemple : quel est le nombre de combinaisons permettant de former 3 ponts disulfures à partir de 6 cystéines ?

• la première cystéine peut être appariée avec n'importe laquelle des 5 autres cystéines pour former le premier pont
• il reste 4 cystéines qui peuvent s'apparier de 3 manières différentes
• il reste 2 cystéines qui s'apparient.

  Soit : 5 x 3 x 1 = 15 combinaisons

De manière générale : pour n ponts disulfures et 2n cystéines, il existe [ (2n)! / 2ⁿn! ] combinaisons.

La distance entre les 2 carbones α de 2 résidus cystéine impliqués dans un pont disulfure est de 4.2 Å à 7.5 Å.

L'entité structurale formé par 2 cystéines reliées par un pont disulfure s'appelle une cystine.

La formation d'un pont disulfure est une réaction d'oxydo-réduction réversible : cette réversibilité dépend du potentiel rédox du milieu et du pH.

c. La réaction de formation d'un pont disulfure

Au cours de la réaction d'échange [thiol - disulfure], un anion thiolate R₁S^- déplace un soufre du pont disulfure R₂-S-S-R₃.

Dans l'état de transition, la charge négative du thiolate est délocalisée sur les 3 atomes de soufre.

Les ponts disulfures sont formés et réduits au sein des protéines par 2 réactions d'échange [thiol - disulfure] avec un agent oxydo-réducteur tel que le dithiothréitol (DTT oxydé / DTT réduit) ou le glutathion (GSSG / GSH).

La réaction d'échange [thiol - disulfure] peut aussi avoir lieu au sein d'une même protéine : un groupe thiolate d'une protéine peut attaquer un pont disulfure de la même protéine, conduisant à un remaniement des ponts disulfures.

4. Les protéines disulfide isomérases (PDI) et Ero1p

Les protéines disulfide isomérases (PDI - EC 5.3.4.1) catalysent le ré-arrangement correct dans le réticulum endoplasmique des ponts disulfures des protéines néo-synthétisées.

Ce sont des protéines à plusieurs domaines. Ci-dessous, structure des domaines prolyl 4-hydroxylase de la PDI de Homo sapiens - Kemmink et al. (1996 et 1999).

Le site actif du domaine prolyl 4-hydroxylase de la PDI est constitué par les 2 cystéines C₃₆GHC₃₉ qui forment un pont disulfure. Codes : PDB 1MEK et 2BJX

Pour oxyder les groupements thiols en disulfure des protéines cibles, les cystéines du site actif de la PDI doivent être maintenues dans l'état oxydé.

Ero1p est une flavoenzyme associée à la membrane qui forment des ponts disulfures et les transfère à la PDI. Cette dernière peut alors oxyder les cystéines des protéines substrats.

Le mécanisme de l'échange [thiol / disulfure] entre Ero1p et la PDI est le suivant :

• Un pont disulfure de Ero1p subit une attaque nucléophile par un anion thiolate issu de la cystéine C₃₆ du site actif de la PDI.
• L'intermédiaire disulfure mixte qui en résulte subit à son tour une attaque intramoléculaire par un anion thiolate issu de la cystéine C₃₉ du site actif de la PDI.

Source : Frand et al. (2000)

Source : Gross et al. (2004)

Les 5 ponts disulfures intra-chaînes de Ero1p : CYS 90 - CYS 349 / CYS 100 - CYS 105 / CYS 143 - CYS 166 / CYS 150 - CYS 295 / CYS 352 - CYS 355

Ero1p contient 9 sites potentiels de N-glycosylation (Asn-X-Ser/Thr). Le motif de son site actif est : C₃₄₉XXC₃₅₂XXC₃₅₅