1. Introduction

2. Découverte des pseudoenzymes

3. Exemples de pseudoenzymes et de familles d'enzymes

4. Différents modes de fonctionnement des pseudoenzymes

5. Conservation des résidus catalytiques et contrainte évolutive à long terme

6. Vitesse d'évolution des sites critiques pour la relation structure - fonction

7. L'annotation et la découverte de pseudoenzymes

8. Liens Internet et références bibliographiques

1. Introduction

Au cours de l'évolution des enzymes, la duplication des gènes et l'accumulation de mutations se sont traduites par la perte de résidus d'acides aminés impliqués dans la catalyse et/ou la fixation du substrat ou par un changement de la spécificité du substrat ou de la réaction catalysée.

Cette évolution a donné naissance à un groupe de protéines, liées aux enzymes, qui ont perdu leur pouvoir catalytique : les pseudoenzymes.

Cependant, la structure tridimensionnelle de l'enzyme d'origine est globalement conservée chez la pseudoenzyme : cette dernière possède donc une nouvelle fonction (non catalytique), souvent liée à la régulation de l'activité de l'enzyme originelle.

• Ainsi, les pseudoenzymes agissent notamment comme modulateurs allostériques, comme échafaudages structuraux pour des complexes de signalisation ou en tant que commutateurs moléculaires.
• Certaines pseudoenzymes ont un domaine inactif combiné à un domaine actif.

Les pseudoenzymes sont universelles :

• La majorité des pseudoenzymes identifiées jusqu'à présent proviennent d'espèces eucaryotes, mais on en trouve également dans les bactéries et les virus.
• Les pseudoenzymes sont très bien conservées.
• Il existe des pseudoenzymes dans plus de 100 familles d'enzymes (au sein desquelles elles représentent 10% à 15% des membres).
• Bien que le nombre de pseudoenzymes varie selon la classe d'enzymes, 5 à 10% des gènes de chaque famille d'enzymes codent ou coderont des pseudoenzymes.

Les pseudoenzymes sont différentes des protéines moonlighting.

2. Découverte des pseudoenzymes

Le premier exemple d'un homologue non catalytique d'une enzyme date de 1967 quand on a découvert que la séquence partielle de l'α-lactalbumine bovine a une identité de séquence d'environ 35% avec le lysozyme de poulet :

• Le lysozyme clive les liaisons β-1,4 des oses complexes des parois des bactéries.
• L'α-lactalbumine est une sous-unité régulatrice (non catalytique) de l'enzyme (non apparentée) β-1,4-galactosyltransférase, du lait de mammifère.

Cette similarité pouvait être causée par une évolution convergente ou divergente : un gène ancestral semblable à un lysozyme avait été dupliqué et l'un de ses descendants avait été muté en un gène codant pour la forme non enzymatique, α-lactalbumine.

Les pseudoenzymes ont des fonctions essentielles dans la signalisation et le métabolisme. Parmi les exemples importants d'homologues inactifs, on peut citer entre autres, les pseudoenzymes liées aux protéases, aux kinases, aux phosphatases, aux enzymes de conjugaison de l'ubiquitine E2 et aux phospholipases.

3. Exemples de pseudoenzymes et de familles d'enzymes

La prévalence d'homologues enzymatiques catalytiquement inactifs est plutôt une règle qu'une exception : la plupart des familles d'enzymes possèdent des pseudoenzymes qui constitueraient environ 10% du protéome.

Les pseudoenzymes sont souvent bien conservées, ce qui implique une pression sélective permanente pour les conserver et maintenir leur fonction.

4. Différents modes de fonctionnement des pseudoenzymes

Les pseudoenzymes (en vert, figure ci-dessous) exercent leurs effets sur la transduction du signal ou sur le métabolisme via des interactions avec d'autres protéines (notamment les enzymes "clientes", en gris) ou avec des substrats (en jaune).

Source : Murphy et al. (2017)

(a) Régulation allostérique (positive ou négative) de l'activité catalytique d'une enzyme "cliente" (fréquemment, une enzyme apparentée).

(b) Les domaines d'une pseudoenzyme peuvent subir une modification post-traductionnelle (indiquée par une étoile) comme l'ubiquitinylation, la (dé)-phosphorylation ou le clivage protéolytique, susceptible de faire basculer la structure de la pseudoenzyme dans une conformation ayant une autre fonction.

(c) En jouant un rôle de "domaine d'interactions protéiques", les pseudoenzymes peuvent servir de "noyau" d'assemblage des sous-unités constitutives de complexes protéiques pour rapprocher une enzyme de son substrat (en haut) ou réguler la localisation des protéines, leur stabilité ou le contrôle qualité (en bas).

(d) Les pseudoenzymes peuvent entrer en compétition avec leurs enzymes canoniques actives et, ainsi, empêcher l'assemblage de complexes protéiques (en haut) ou séquestrer les molécules de substrat, dès lors indisponibles pour la réaction enzymatique (en bas).

5. Conservation des résidus catalytiques et contrainte évolutive à long terme

Les résidus d'acides aminés des sites catalytiques sont remarquablement conservés. Le site catalytique des enzymes induit une contrainte évolutive à long terme :

• La conservation évolutive des résidus d'acides aminés des enzymes décroît de façon approximativement linéaire avec l'augmentation de leur distance avec le résidu catalytique le plus proche jusqu'à environ 27,5 Å, ce qui englobe en moyenne 80% des résidus (voir la figure ci-dessous) indépendamment de leur compacité ou de leur accessibilité au solvant.
• Cette tendance est vérifiée pour les enzymes monomères et multimères, indépendamment de la taille de l'enzyme et/ou de l'emplacement du site actif dans la structure.
• Contrairement aux résidus catalytiques, les sites d'interactions protéine-protéine ne sont que faiblement conservés et n'imposent que de très faibles gradients de conservation.

Source : Jack et al. (2016)

Figure a, ci-dessus : Taux d'évolution spécifique d'un site en fonction de la distance avec le résidu catalytique le plus proche. La courbe représente le taux moyen pour tous les résidus d'acides aminés, calculé à partir d'un modèle additif généralisé. Les taux augmentent presque linéairement avec la distance jusqu'à 27,5 Å (ligne verticale).

Figure b, ci-dessus : Diagramme de densité des résidus avec une distance donnée par rapport à un résidu catalytique. La ligne rouge verticale indique une distance de 27,5 Å et 80% des résidus se situent en dessous de cette distance.

La comparaison des propriétés évolutives des enzymes avec celles de leur homologue pseudoenzyme (qui adoptent le même repliement tridimensionnel) indique que la contrainte évolutive à long terme chez les enzymes est significativement réduite chez les pseudoenzymes, malgré une similarité structurale très élevée (RMSD ≈ 1,5 Å en moyenne).

Cette réduction significative est observée également avec les pseudoenzymes qui conservent la capacité de fixer les ligands de leur homologue enzyme.

• La contrainte évolutive à long terme des enzymes serait donc essentiellement induite par la présence du site catalytique plutôt que par la structure tridimensionnelle de l'enzyme.
• De plus, cette contrainte dépendrait principalement de la fonction catalytique du site actif plutôt que de sa capacité de fixation du substrat.

6. Vitesse d'évolution des sites critiques pour la relation structure - fonction

La vitesse d'évolution peut être défini comme le nombre de substitutions (mutations fixes) par unité de temps au cours de l'évolution des séquences des protéines.

Les contraintes structurales et fonctionnelles régissent la vitesse d'évolution des sites critiques pour la relation structure - fonction des protéines :

• Les contraintes structurales sont la cause principale de la variation des vitesses d'évolution : les vitesses augmentent depuis l'intérieur de la protéine (inaccessible au solvant, compacte et rigide) qui évolue lentement à la surface de la protéine (exposée au solvant et peu compacte) qui évolue rapidement.
• Les contraintes liées au maintien de la fonction des protéines entraînent une évolution lente des sites directement impliqués et des sites voisins (voire, dans certains cas, de sites distants via des effets à longue portée).

Source : Echave et al. (2016)

Les modèles biophysiques (basés en particulier sur l'accessibilité au solvant et la compacité locale) indiquent que la vitesse d'évolution spécifique d'un site est liée au changement de stabilité thermodynamique qu'induit une mutation donnée. Cependant, les modèles actuels n'expliquent (au plus) qu'environ 60% de la variation observée de la vitesse d'évolution spécifique d'un site.

7. L'annotation et la découverte de pseudoenzymes

a. L'annotation des pseudoenzymes

La base de données UniProtKB est un recueil d'informations sur les protéines : plus de 150 millions de protéines y sont recensées.

Dans le cas des enzymes (qui représentent 20 à 40% de la plupart des protéomes) :

• UniProtKB fournit des informations liées à la fonction telles que la classification EC ("Enzyme Commission"), des données sur l'activité enzymatique et sa régulation, les cofacteurs, des données structurales, les voies métaboliques et bien d'autres.
• De plus, l'analyse informatisée et les données structurales permettent d'annoter la séquence en identifiant les sites actifs et les sites spécifiques liés à la régulation de la fonction.

Cependant, si l'annotation des enzymes est bien définie, celle des pseudoenzymes est plus délicate :

• Comment les identifier ?
• Comment évaluer et annoter leur manque d'activité catalytique ?

Dans le champ de recherche de l'interface web de UniProt (en haut de la page), le terme de recherche "inactive" dans le champ "Protein name" permet de récupérer des fichiers de pseudoenzymes.

• Dans l'item "Function" d'un fichier Uniprot d'une pseudoenzyme, un paragraphe "Caution" (mise en garde) décrit les éléments en faveur de l'absence d'activité enzymatique.

• Dans l'item "Names & Taxonomy", le mot-clé "Inactive" apparaît pour décrire les données expérimentales ou structurales en faveur de l'absence d'activité enzymatique.

En ce qui concerne les mots-clé de l'ontologie :

• La recherche de pseudoenzymes doit s'appuyer sur une annotation comprenant au moins un terme GO lié à la catalyse avec un qualificatif "NOT - enables".
• C'est le moyen le plus robuste de capturer toute information sur l'absence d'activité ("lack of activity").
• En effet, c'est un crible facile à filtrer, il est associé à un code ECO ("Evidence & Conclusion Ontology", ECO:0000006) et il permet d'annoter les activités enzymatiques multiples.

Voir l'ensemble des fichiers des homologues Swiss-Prot/EMBL-EBI avec ou sans preuves expérimentales de la fonction, où Les pseudoenzymes ont été identifiées sur la base de l'absence d'annotation de la catalyse ou de l'absence explicite d'annotations de fonction ("Combined, Experimental, Filtered Combined, Filtered Experimental").

La figure ci-dessous montre la répartition des enzymes et des pseudoenzymes selon les espèces pour les ensembles de données "Combined" et "Filtered Experimental" :

• Les pseudoenzymes sont davantage représentées chez les animaux : leurs modes de régulation plus sophistiqués et complexes est probablement à l'origine de l'enrichissement en pseudoenzymes.
• Le faible nombre de pseudoenzymes chez les bactéries est étonnant car la plupart des enzymes du jeu de données combiné sont d'origine bactérienne.

Source : Ribeiro et al. (2019b)

b. La découverte de pseudoenzymes

Les critères actuels pour identifier les pseudoenzymes découlent des preuves de l'activité catalytique chez leurs homologues enzymes actives. En d'autres termes, la prédiction qu'une protéine est une pseudoenzyme dépend de la connaissance du mécanisme catalytique et des résidus impliqués des membres catalytiquement actifs de la famille à laquelle cette pseudoenzyme appartient.

Il existe des pseudoenzymes qui ont conservé le site actif et, par ailleurs, la mutation d'un résidu catalytique n'abolit pas forcément l'activité catalytique.

• Les prédictions basées uniquement sur l'absence d'annotation liée à la catalyse (la classification EC par exemple) risquent de surestimer le nombre de pseudoenzymes.
• Une règle simple basée sur la mutation de tout résidu catalytique risque de classer à tort des enzymes en tant que pseudoenzymes ou de fausser l'identification de certaines pseudoenzymes.

L'alignement des séquences d'acides aminés des protéines est principalement utilisée pour prédire l'absence de résidus d'acides aminés dont on a démontré expérimentalement qu'ils sont indispensables à l'activité enzymatique.

• Par exemple, PfpTKL ("Plasmodium falciparum tyrosine kinase like") possède une région ressemblant au lobe N-terminal d'une tyrosine kinase de Bruton (BTK) en amont de son domaine pseudokinase. La lysine conservée qui fixe l'ATP est indiquée par une flèche rouge (figure ci-dessous).

Source : Gnangnon et al. (2019)

• Cependant, dans le cas d'enzymes dont les résidus d'acides aminés impliqués dans la catalyse ne sont pas identifiés ou d'un mécanisme catalytique qui aurait évolué pour aboutir à l'emploi d'autres résidus (voir par exemple le domaine kinase de PknI de Mycobacterium tuberculosis - code PDB : 5M06 - Lisa et al., 2017), l'analyse des séquences par alignements est peu (voire pas) efficace.

La comparaison des données structurales (quand on en dispose) d'une enzyme et de sa pseudoenzyme permet de décrire :

• L'évolution du site actif et le mécanisme réactionnel (résidus et/ou motifs clés).
• La manière dont la pseudoenzyme remplit ses fonctions non catalytiques.

Source : Ceccarelli et al. (2019)

La pseudoenzyme [FAM105A / OTULINL] est une pseudodésubiquitinase de la famille "Ovarian Tumor Protease" (OTU). Le domaine OTU présente des déficiences structurales du site actif et du site de fixation du substrat (Cys 139 du site actif remplacée par Asp 139) responsables de l'absence d'activité catalytique vis-à-vis des liaisons avec l'ubiquitine et de l'incapacité de FAM105A à se lier à l'ubiquitine contrairement à l'enzyme [FAM105B / OTULIN] catalytiquement active.

La mise au point d'outils de prédiction fiables permettant d'identifier et d'annoter correctement les pseudoenzymes nécessite d'accroître les connaissances des mécanismes de toutes les réactions enzymatiques.

A cela s'ajoute le développement de recueils de données tels que :

• La ressource unifiée M-CSA ("Mechanism and Catalytic Site Atlas", atlas des mécanismes et des sites catalytiques) qui combine les informations de :
  • MACiE ("Mechanism, Annotation and Classification in Enzymes") : base de données des mécanismes chimiques des réactions enzymatiques.
  • CSA ("Catalytic Site Atlas") : base de données des sites actifs et des résidus catalytiques des enzymes de structure 3D connue.
• La base de données PDB qui regroupe l'ensemble des structures des macromolécules biologiques résolues expérimentalement.
• La base de données sur l'évolution des domaines structuraux des protéines CATH/Gene3D.

Enfin, sur le plan théorique, l'augmentation des performances des logiciels de modélisation moléculaire des protéines et des méthodes d'apprentissage profond (intelligence artificielle) seront déterminantes.