GenBank

Base de données des fichiers GenBank (extension ".gbk") de toutes les séquences de nucléotides.

Fichier GenBank : voir le détail de son annotation/nomenclature (explication de chaque champs et sous-champs ou "Features").

GenPept

Base de données des fichiers GenPept (extensions ".gp") de traduction (acides aminés) de toutes les séquences codantes ("CoDing Sequence" - CDS - nucléotides).

Le format d'un fichier GenPept dérive de celui du fichier parent GenBank et son contenu est synchronisé avec chaque nouvelle version de ce fichier.

2. Combien de fichiers GenPept le moteur de recherche "Entrez" renvoie-t-il avec le mot clé "protein" ?

En combien de pages ces fichiers sont-ils répartis avec 200 résultats par page ?

≈ 1,29 milliards de fichiers.

≈ 6,4 millons de pages.

1. Aller au NCBI. Rechercher les séquences protéiques de la lactate déshydrogénase. Attention : anglais, abréviation, emploi des opérateurs logiques (Booléens) : "AND", "OR" et "NOT".

Avec l'option "Advanced" (lien en haut de la page), affiner la recherche avec EC 1.1.1.27 et Arabidopsis thaliana dans les résultats précédents :

"#1 AND in builder" puis taper "1.1.1.27" avec le champs "EC/RN Number" du menu déroulant.
"#2 AND in builder" puis taper "Arabidopsis thaliana" avec le champs "Organism" du menu déroulant.

Enregistrer la séquence au format FASTA du fichier AAC02678.

≈ 106.300 résultats

1 séquence : AAC02678

Comment sait-on qu'il s'agit d'une enzyme ?

Quelle réaction catalyse-t-elle ?

Dans quelle voie métabolique ?

• E.C. = "Enzyme Commission" (voir un cours sur les enzymes).
• 1.1.1 : oxydoréductases (1) agissant sur le groupe CH-OH du donneur (1) avec NAD⁺ ou NADP⁺ comme accepteurs d'électrons (1).
  • L-lactate déshydrogénase : E.C. 1.1.1.27
  • D-lactate déshydrogénase : E.C. 1.1.1.28
• (S)-lactate + NAD⁺ <=> pyruvate + NADH + H⁺
• La fermentation.

Remarques

• EC/RN Number : EC = Enzyme Commission - RN = Registry Number
• Voir une liste des déshydrogénases.

• Il ne contient qu'un acide aminé.
• Cet acide aminé est la méthionine codée par le codon d'initiation de la traduction dans tous les ARN messagers.

2. Ouvrir le fichier GenPept NP_002292. Examiner les informations des différents champs.

Ouvrir l'onglet "Graphics" (en haut). Examiner la partie "site Features - CDD"

Zoomer à 50% (loupes au centre) afin qu'apparaissent les lettres des acides aminés. Survoler les sites de fixation du NAD⁺ et du substrat avec les flèches larges (au centre).

• Quelles sont les positions des acides aminés du site de fixation du NAD⁺ ?

• Quelles sont les positions des acides aminés du site de fixation du substrat ?

Quels acides aminés sont communs aux deux sites ?

Pourquoi les acides aminés de chacun de ces sites ne sont-ils pas contigus dans la séquence ?

Acides aminés du site de fixation du NAD⁺ :

• Positions 52, 54, 57, [95 - 99], 136, 138, 161, 165, 193, 248 et 252
• En particulier : ... VT₉₅AGAR₉₉Q ...

Acides aminés du site de fixation du substrat :

• Positions 100, 106, 138, 169, 193, 238 et 248.
• En particulier : RQ₁₀₀Q ... TR₁₀₆L ... SN₁₃₈P [.....] YT₂₄₈S

Les acides aminés N₁₃₈, H₁₉₃ et T₂₄₈ sont communs aux 2 sites de fixation : ils établissent donc des liaisons avec la molécule de coenzyme et avec la molécule de substrat.

Chacun des sites de fixation résultent du regroupement d'acides aminés dans l'espace via le repliement de la chaîne polypeptidique et la formation de domaines indépendants.

3. Cliquer sur le lien ci-contre : "Conserved Protein Domain Family - LDH1".

• A quelle super-famille de protéines appartiennent les lactate déshydrogénases ?
• Les déshydrogénases à NAD(P) appartiennent-elles toutes à la même super-famille de protéines ?
• Appartiennent-elles toutes à la même famille de protéines ?
• Qu'ont en commun ces familles ?

• "NAD(P)-binding Rossmann fold superfamily"
• Oui
• Non
• Le domaine de fixation du NAD(P)

Quelles sont les particularités physico-chimiques de la glycine ?

• Acide aminé peu encombrant : l'atome H constitue la plus petite chaîne latérale.
• Caractère polaire : possibilité de formation de liaisons hydrogènes.

Ces caractéristiques permettent une certaine fléxibilité de la chaîne polypeptidique : la glycine est souvent dans des portions de séquence d'acides aminés qui forment des boucles.

Aller à InterPro. Rechercher "lactate dehydrogenase nad+ Arabidopsis".

Pourquoi obtient-on autant de résultats ?
A quoi correspondent les informations de la colonne "Source database" ?

Il y des résultats pour la lactate déshydrogénase et pour d'autres déshydrogénase.
Certains résultats ont trait à des informations plus générales. Exemple : IPR036291

A certaines des bases de données constitutives du consortium InterPro.

Dans la liste de résultats, afficher plus de 20 résultats par page.
Cliquer sur le lien vers le motif du site actif de la LDH de la base de données Prosite

Quelle est l'expression régulière ? L'interpréter.

Lien "View PS00064 in PROSITE patterns".

Expression régulière : [LIVMA]-G-[EQ]-H-G-[DN]-[ST]

4. Rechercher dans la base de données Uniprot le fichier correspondant au fichier GenPept obtenu au NCBI.

• Quel est le numéro d'accession du fichier Uniprot ?

• Quelles informations suplémentaires obtient-on ?

Numéro d'accession : O49191 (O49191_ARATH)

Un trés grand nombre d'informations supplémentaires. Notamment :

• La réaction enzymatique, la localisation subcellulaire et de trés nombreux liens vers diverses bases de données (InterPro, NCBI , PDB, ...).
• L'ontologie et notamment l'annotation du gène codant la lactate déshydrogénase dans la base de données TAIR (dédiée à Arabidopsis thaliana) : "Lactate/malate dehydrogenase family protein" & locus AT4G17260.

A quelle protéine correspond le fichier GenPept ABI54333 ?

Vérifier avec le programme d'alignement de séquences MULTALIN si les séquences des fichiers AAC02678, O49191 et ABI54333 sont identiques (dans ce cas les valeurs du paramètre "check" au dessus de l'alignement obtenu sont identiques).

Pourquoi le fichier ABI54333 n'est-il pas renvoyé dans la requête d'origine au NCBI ?

ABI54333 : lactate déshydrogénase de Arabidopsis thaliana.

• Les séquences AAC02678 et O49191 sont identiques.
• Les séquences AAC02678 et ABI54333 diffèrent de 1 acide aminé : V155 => I155 (différence conservative).

Le champs "DEFINITION" du fichier GenPept ABI54333 contient "At4g17260 [Arabidopsis thaliana]" et non "lactate dehydrogenase".

5. Aller à ScanProsite.

• Choisir l'option qui permet de comparer une séquence de protéine à une collection de motifs.
• Entrer la séquence FASTA de la lactate déshydrogénase AAC02678.
• Ajuster les paramètres et lancer la recherche.
• Dans la page de résultat, trouver le lien vers le motif consensus ("consensus pattern") du site actif des lactate déshydrogénases.

Quelle est l'expression régulière de ce motif ?
Pourquoi est-elle identique à la précédente (voir ci-dessus) ?

Lien vers le motif : PS00064

[LIVMA]-G-[EQ]-H-G-[DN]-[ST]

Prosite fait partie du consortium InterPro

6. Aller à PHI-BLAST au NCBI.

• Fenêtre "Enter Query Sequence" : entrer la séquence FASTA de AAC02678.
• Champs "Organism" : sélectionner Homo sapiens en tapant les premières lettres dans le un menu déroulant qui s'ouvre=> taxid:9606 (attention aux différentes orthographes dans le menu déroulant).
• Sélectionner l'algorithme PHI-BLAST : une petite fenêtre s'ouvre => entrer l'expression régulière du motif consensus (ci-dessus).
• Ouvrir l'item "Algorithm parameters" : sélectionner 50 séquences dans le menu "Max target sequences".
• Lancer PHI-BLAST pour effectuer la recherche de séquences homologues et/ou similaires de la lactate déshydrogénase de l'homme.

Sélectionnez (cocher) 10 résultats caractérisés par des E-value très différentes les unes des autres. Puis dans le menu déroulant "Download" (au dessus de la liste des résultats), sélectionner "FASTA (complete sequence)" => récupérer le fichier texte ainsi créé.

Voir un descriptif de BLAST.

7. Avec MULTALIN, alignez la séquence de la lactate déshydrogénase de Arabidopsis thaliana (AAC02678) avec les 10 séquences FASTA récupérées de PHI-BLAST.

• Le but est de mettre en exergue un motif G-X-G-X-X-G du côté N-terminal des séquences : il faut donc "jouer" sur le choix de la matrice (exemple : Dayhoff), des valeurs de gap (exemple : 6 - 0) et éliminer les séquences trop longues ou trop courtes sauf celle de Arabidopsis thaliana.

• Ecrire l'expression régulière la plus précise de ce motif (syntaxe Prosite) qui tient compte de toutes les séquences conservées.

8. Illustration : structure du domaine liant le NAD(P)⁺ - le pli Rossmann

• Récupérer la séquence de la lactate déshydrogénase de Squalus acanthias : Uniprot P00341.
• Refaire l'alignement MULTALIN en y ajoutant cette séquence : repérer le motif spécifique de la lactate déshydrogénase de Squalus acanthias (GVGAVG).

Voir les spécificités du pli rossmann des déshydrogénases à NAD(P)⁺ pour la suite.

b. Prédiction de la structure secondaire

Le motif consensus GXGXXG riche en glycine forme une boucle ("glycine-rich P-loop motif") qui effectue un tour serré entre la fin du premier feuillet β (β7) et le début de l'hélice de fixation du dinucléotide (α6) au sein du pli Rossmann.

Effectuer une prédiction de la structure secondaire de la séquence de lactate déshydrogénase de Arabidopsis thaliana.

Repérer les acides aminés du Pli Rossmann :

• Sont-ils prédits dans une structure secondaire correcte ?
• Et les acides aminés du motif GXGXXG ?

a. Prédiction de la structure secondaire avec HHpred.

b. Exemples d'autres logiciels : Jpred - CFSSP - GOR

(Etre patient pour les résultats).

S(4)-[DS]-x-[DE]-[EGV]-x(1,7)-[EG]-x(1,2)-[KR](4)

Exemple : SSSSSDDEEEEKRKR

2. Le motif de fixation du calcium de la calmoduline s'appelle motif "EF-hand" composé d'environ 30 acides aminés :

• Ce motif contient 2 hélices α notées E et F (figurées respectivement par l'index et le pouce d'une main - figure ci-contre), reliées par une boucle.

• Lors de la fixation du calcium, l'hélice F passe d'une conformation "fermée" (apo-CaM) à une conformation "ouverte" (holo-CaM).

La calmoduline fixe 4 atomes de calcium :

• Chacune des 4 boucles de liaison au calcium est inclue dans un motif "EF-hand" et ont des séquences homologues.

• La syntaxe PROSITE du motif consensus de ces séquences est : [DN]-x-D-G-[DN]-G-[TYQ]-x(4)-E

Source : PFAM (PF00036)

Quelles sont les propriétés physico-chimiques des acides aminés de ce motif consensus ?

Pourquoi ?

• Acides aminés acides (D et E) ou déprotonable (Y) donc chargés moins au pH cellulaire.
• Acides aminés polaires (G, N, Q, T et Y à pH 7) donc susceptibles d'établir des liaisons hydrogène ou électrostatiques.

Ces propriétés physico-chimiques permettent la fixation de Ca²⁺ (cation divalent).

Ci-après, la séquence et la position des acides aminés du 1er motif "EF-hand" qui fixe le Ca²⁺de la calmoduline de Homo sapiens (exemple : CAA36839) :
FD₂₁KD₂₃GD₂₅G ... KE₃₂L ... VD₅₇AD₅₉D ... GN₆₄G ... PE₇₁F

Retrouve-t-on le motif PROSITE ci-dessus ?

La séquence FD₂₁KD₂₃GD₂₅G ... KE₃₂ répond à l'expression régulière du motif PROSITE.

3. Aller à ScanProsite.

Rechercher avec l'option adaptée le motif consensus de fixation du calcium (motif "EF-hand") en utilisant l'expression régulière [DN]-x-D-G-[DN]-G-[TYQ]-x(4)-E.

Analyser les résultats (exemples : "polymerase processivity factor component A20", "Calcium-binding allergen Bet v3", "Calbindin", ...).

Quelles informations tire-t-on ?

• Il existe un très grand nombre de protéines qui fixent le calcium.
• Ces protéines sont impliquées dans des processus biologiques très divers.
• Elles ont cependant des séquences en acides aminés caractérisées par la conservation de motifs consensus identiques de fixation du Ca²⁺.

Repérer le résultat P84074 :

• De quelle protéine s'agit-il ?
• Combien de fois le motif recherché est-il présent ?
• Pourquoi trouve-t-on ce motif ?

• Hippocalcine ("Neuron-specific calcium-binding protein hippocalcin") de l'homme.
• Le motif est trouvé 1 fois.
• Cette protéine fixe le calcium.

4. Consulter le fichier PROSITE du motif "EF-hand" : PS00018

Récupérer le motif complet (attention au retour à la ligne / le point final n'en fait pas partie).

Effectuer une recherche ScanProsite avec ce motif (choisir l'option 2).

Fenêtre "STEP2 - Select a PROTEIN sequence database" :

• Cocher la case "Exclude fragments (concerns UniProtKB only)".
• Ouvrir le menu "Filters" et limiter la recherche "On taxonomy" à "Homo sapiens".

Limiter le nombre de résultats à 1000 (option "Maximum number of displayed matches").

Pourquoi le résultat est-il étonnant ?

Le motif est très long : le nombre de séquences qui y répondent est très grand.

En conséquence, des protéines ou enzymes qui ne fixent pas le calcium ont malgré tout une partie de leur séquence qui correspondent à ce motif PROSITE.

a. Aller au NCBI. Effectuer une recherche de récepteur de l'insuline de l'homme.

• Quels mots-clés est-il judicieux d'employer ?

• Pourquoi obtient-on autant de résultats ?

Exemple : (insulin receptor[Protein Name]) AND Homo sapiens[Organism]

On obtient beaucoup de fichiers correspondant :

• à une séquence incomplète ("partial")
• à des molécules en relation avec le récepteur de l'insuline

Avec les fonctionalités de "Advanced", récupérer le sous-ensemble de fichiers qui ne contiennent pas le mot "partial".

Combien de fichier(s) obtient-on ?

Le fichier AAA59452 est intéressant.

• Cependant il n'est pas dans les résultats. Pourquoi ?
• Elimine-t-on ce fichier avec le filtre précédent ?

Réfléchir à la requête la plus exacte (si il y en a une) pour n'obtenir que des fichiers de séquences complètes du récepteur de l'insuline de l'homme.

5 fichiers sont renvoyés.

• Le fichier AAA59452 contient le mot "Partial" (P majuscule) donc il est éliminé.
• Filtrer avec ce mot est efficace mais il est difficile de gérer la casse (majuscule / minuscule).

Il n'y a pas de requête évidente à moins de consulter un grand nombre fichiers GenPept pour noter les mots à ne pas utiliser dans le filtre pour éviter d'éliminer des fichiers intéressants.

b. Récupérer la séquence FASTA du fichier AAA59452 et effectuer une recherche de séquences homologues avec BLAST.

• Dans la page de résultats, ouvrir l'onglet "Graphic Summary".
• Il apparaît une figure avec l'entête "Putative conserved domains have been detected, click on the image below for detailed results" : cliquer sur la figure.

Une nouvelle page s'ouvre. Comparer cette figure à celle du cours sur le récepteur de l'insuline.

Ce récepteur est constituée d'un grand nombre de domaines.

Un domaine est une région de la chaîne polypeptidique :

• apte à se replier indépendamment
• qui possède une fonction propre

Cliquer sur le signe "+" de la fenêtre "List of domain hits" : on obtient la séquence des différents domaines.
Dans quel domaine trouve-t-on la séquence "LGQGSFGMVY" ?
De quel domaine du récepteur s'agit-il ?

Le domaine PTKc_InsR.

Domaine catalytique à activité protéine tyrosine kinase.

Dans la figure du haut de la page, cliquer sur l'un quelconque des triangles oranges de la ligne intitulée "ATP binding site".

• A quel domaine du récepteur de l'insuline appartient ce site ?
• Quel est le rôle de la fixation de l'ATP ?
• Retrouve-t-on la séquence "LGQGSFGMVY" dans l'alignement des séquences de récepteurs en bas de la page ?

"Catalytic domain of the Protein Tyrosine Kinase, Insulin Receptor"

"PTKs catalyze the transfer of the gamma-phosphoryl group from ATP to tyrosine (tyr) residues in protein substrates"

Oui, dans la partie N-terminale des séquences.

Trouver la séquence d’un siRNA dans la séquence de l’ARN messager (GenBank NM_003380) codant la vimentine de l’homme :

Uniprot : Homo sapiens vimentin mRNA

Il faut trouver une séquence de 21 nucléotides dans l’ARNm cible qui commence par un dinucléotide AA.

On cherche le codon d'initiation de la transcription (AUG) : toutes séquences commençant par AA (et les 19 nucléotides suivants) constituent un site cible potentiel pour les siRNA.