INTRODUCTION

I. Le contexte scientifique et socio-économique.

L'un des objectifs de l'UMR Physiologie Moléculaire des Semences (UMR 1191)est d'acquérir une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires qui régissent le métabolisme des semences au cours des différentes phases de leur germination puis de leur développement.

Cet objectif s'inscrit dans un contexte socio-économique ayant pour but la maîtrise et l'amélioration de la qualité germinative des semences. La filière française des semences est un secteur agronomique en pleine croissance depuis les années 80.

Aujourd'hui, la production de semences atteint environ 1,3 million de tonnes, plaçant ainsi la France au premier rang européen et au deuxième rang mondial après les Etats Unis. Réalisant un chiffre d'affaires de 790 millions d'euros, la France a exporté pour plus de 500 millions d'euros pour la campagne 2000-2001.

Les semences étudiées par l'UMR 1191 sont des légumineuses d'intérêt agronomique parmi lesquelles Pisum sativum (le pois). L'effort est aussi porté sur Medicago truncatula, modèle génétique des légumineuses faisant l'objet d'une Action Transversale Structurante de l'INRA et de programmes internationaux de génomique à grande échelle.

II. Le métabolisme azoté et la glutamate déshydrogénase.

  • quand l'azote (sous forme d'ammoniac) est assimilé par condensation sur l'alpha-cétoglutarate, la GDH synthétise le glutamate (qui est le substrat de la glutamine synthètase)
  • cependant, cette enzyme peut aussi catalyser essentiellement la réaction réverse (relarguage de l'ammoniac à partir du glutamate) ou bien encore catalyser les deux réactions de la même manière
  • il existe donc 3 isoformes de la GDH

L'isoforme qui nous intéresse est celle qui catalyse essentiellement la réaction de synthèse du glutamate : la GDH EC 1.4.1.4.

Et ce d'autant plus, qu'elle n'est pas caractérisée chez les plantes, tant du point de vue de sa structure primaire (aucune GDH EC 1.4.1.4 de plante n'a été à ce jour purifiée et séquencée), ni évidemment du point de vue structural. Une seule séquence nucléotidique est connue (Chlorella sorokiniana).

III. Thème du stage : la construction de banques d'ADNc.

Cette absence de données est la raison pour laquelle 4 banques d'ADNc ont été construites :

  • les matériels biologiques choisis ont été les semences de Pisum sativum et de Medicago truncatula
  • pour chaque type de matériel, à 2 temps d'imbibition pendant la phase de germination sensu stricto
  • les banques ont été construites à partir de graines entières (Pisum sativum) et d'axes embryonnaires (Medicago truncatula)

Génoplante est un grand programme fédérateur de génomique végétale qui associe en France la recherche publique (INRA, CIRAD, IRD, CNRS) et les principales sociétés privées impliquées dans l'amélioration et la protection des cultures (Biogemma, Aventis Cropscience, Bioplante).

Il n'existe pas de banque du type de celles qui ont été construites (germination sensu-stricto) parmi les banques de Pisum sativum et de Medicago truncatula qui sont regroupées dans les bases de données de Génoplante.

La première utilisation des banques est d'isoler une (ou des) séquence(s) codant l'isoforme EC 1.4.1.4 de la GDH dans le but d'exprimer et de caractériser la protéine recombinante.