Correction exercices pour les travaux pratiques de Biochimie

Exercice N°4

4a. Sachant que l'on dispose d'une solution stock de BSA à 1 mg.mL.1 , calculez les volumes (et éventuellement la dilution à effectuer au préalable) à prélever de la solution de BSA et de la solution tampon pour faire une gamme étalon : 0, 2, 4, 6, 8 et 10 g de BSA.

Tracer la droite : A595 = f (quantité de BSA). Pourquoi faut-il attendre avant de mesurer l'absorbance ?

4b. La détermination de la concentration de la solution de protéines à doser se fait en parallèle. Les résultats sont les suivants :

Volume prélevé de solution à doser (L) 10 60
Dilution préalable de la solution à doser Non diluée 3
A595 0,51 0,84

A partir de la droite étalon et de ces valeurs, calculez la concentration en protéines de la solution à doser.

4c. Sur la base du tableau de l'énoncé, comparez les avantages et inconvénients des différentes méthodes de détermination de la concentration en protéines.

Réponse

4a & b. Pour avoir une précision plus importante, on peut diluer la solution mère de BSA d'un facteur 10. La concentration est : [BSA] = 0,1 mg.mL-1 ou 0,1 µg.µL-1. Ainsi, pour une même quantité de BSA, on prélève des volumes 10 fois plus importants, ce qui minimise l'erreur liée au pipetage.

Le tableau suivant résume les volumes et quantité pour la gamme étalon :


Volume de BSA à 0,1 µg.µL-1 (µL) 0 20 40 60 80 100
Volume de tampon (µL) 100 80 60 60 20 0
Quantité de BSA (µg) 0 2 4 6 8 10
Réactif (bleu de Coomassie) (mL) 1
Les échantillons sont mis à l'obscurité (15 min) avant de mesurer l'absorbance afin que l'équilibre de fixation protéine - colorant s'établisse
A595 0,13 0,40 0,48 0,85 0,95 1,21

Attention :

  • l'absorbance du tube sans BSA n'est pas nulle (A595 = 0,13).
  • C'est parce que l'absorbance du colorant non complexé n'est pas nulle à 595 nm.
  • Cette absorbance résiduelle doit être retranchée aux valeurs obtenues avant de tracer la droite étalon.

On obtient la droite étalon : A595 = f (quantité de BSA).

Celle-ci permet de déterminer la concentration en protéine de la solution à doser.

Le pigment (bleu de coomassie) :

  • s'adsorbe aux résidus d'acides aminés His, Lys et surtout Arg
  • et dans une moindre mesure (interactions plus faibles) avec Trp, Tyr et Phe

La méthode est donc basée sur le fait que la longueur d'onde d'absorbance maximale d'une solution de bleu de coomassie augmente de 465 nm à 595 nm quand le colorant est fixé aux peotéines

Bradford, M. (1976) "A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding" Anal. Biochem. 72 p 248 - 254

Voir un complément sur la méthode de Bradford.

Dosage concentration proteine protein bradford biochimej

4c. Avantages et inconvénients des différentes méthodes de détermination de la concentration en protéines.
Méthode Principe Avantage(s) Inconvénient(s)
Johann Kjeldahl (1883) Méthode de dosage indirecte de la concentration des protéines via leur contenu azoté : l'échantillon est soumis à une hydrolyse à l'acide sulfurique chaud qui libère le contenu azoté.
  • Ntotal ---> NH4+ qui est titré par l'acide borique
  • matière organique ---> formation de CO2 et de H2O
Méthode standard internationale pour le dosage des aliments.
  • méthode reproductible
  • méthode précise
  • tout l'azote ne provient pas uniquement des protéines
  • méthode dangereuse : acide sulfurique chaud
  • méthode longue et lourde
biuret (1949)

Les ions cuivriques (Cu2+) interagissent avec la liaison peptidique à pH alcalin et forment un complexe violet dont l'absorbance est mesurée à 540 nm.

Référence : Gornall, Bardawill, David (1949) J. Biol. Chem. 177, p 751

Méthode peu sensible à la nature de la protéine à doser puisque toutes contiennent des liaisons peptidiques. Méthode moins sensible que les autres.
Lowry (1951) Méthode qui combine le réactif du biuret et celui de Folin - Ciocalteu (1927) : l'acide phosphotungstomolybdique réagit avec les résidus Tyr et Trp. Il se forme un complexe bleuté dont l'absorbance est mesurée entre 500 nm et 750 nm :
  • 500 nm : dosage de fortes concentrations en protéines
  • 750 nm : dosage de faibles concentrations en protéines

Sans doute la méthode la plus utilisée et citée dans la littérature scientifique avec la méthode de M. Bradford.

Référence : Lowry, Rosebrough, Farr, Randall (1951) "Protein measurement with the Folin phenol reagent" J. Biol. Chem. 193, p 251

Méthode plus sensible pour de faibles concentrations en protéines que le Biuret. ----------
absorbance   (voir l'exercice N°7) Méthode qui mesure l'absorbance des résidus d'acides aminés chromophores : Trp, Tyr et Phe.
acide aminé λmax (nm) εM (M-1.cm-1)
Trp 277 - 280 5600
Tyr pH 7 273 - 277 1350
Tyr pH 13 293 - 297 2350
Phe 267 90

A pH 7, c'est essentiellement l'absorbance des Trp que l'on mesure à 277 nm. Le groupement phénol des Phe contribue très peu à l'absorbance globale des protéines.

Le groupement phénol des Tyr est ionisé en ion phénolate avec un pKa = 10,5 :

Dosage concentration proteine protein bradford tyrosine ionisation biochimej

Cette ionisation induit une augmentation du coefficient d'extinction molaire avec un décalage de la longueur d'onde d'absorbance maximale (voir tableau ci-dessus). En conséquence, à pH alcalin c'est essentiellement l'absorbance des Tyr que l'on mesure.

Méthode de loin la plus simple, rapide et précise.

Méthode qui ne souffre d'aucun artéfact lié à l'utilisation d'un colorant.

Il faut que le coefficient d'extinction molaire de la protéine soit connu.

 

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