Exercice phosphatase alcaline

a. Calcul de V_Max

Une vitesse enzymatique est la variation d'une concentration (et non d'une quantité) par unité de temps.

La valeur du coefficient d'extinction pondéral pour le PNP est ε^1% = 1260 g^-1.100 mL.cm^-1. Ce qui signifie qu'une solution de PNP à 1% a une absorbance de 1260 unités DO, pour un trajet optique de 1 cm.

Donc :

1% = 1g dans 100 mL -> 1260 unités DO
=> 139 g dans 100 mL -> 1260 x 139 unités DO
=> 139 g dans 1000 mL -> (1260 x 139) / 10 unités DO
=> 1 mole de PNP par litre -> 17514 unités DO

On obtient ainsi la valeur du coefficient d'extinction molaire : ε_M^PNP = 17514 M^-1.cm^-1

On recalcule V_Max à partir de cette valeur et avec la loi de Beer-Lambert (longueur du trajet optique = 1 cm):
V_Max = 0,24 unités DO.min^-1 = 0,24/(17511 x 1) = 1,37 10^-5 M.min^-1
=> V_Max = 13,7 µM.min^-1

b. Calcul de K_M

La masse molaire dont il faut tenir compte est celle du substrat, puisque l'on calcule K_M. Par ailleurs, le volume réactionnel est de 10 mL.

K_M = 0,17 mg.tube^-1 = 0,17 10^-3 g dans 10 mL
=> K_M = (0,17 10^-3/371) moles dans 10 mL = (0,17 10^-3 x 1000) / (371 x 10) moles dans 1L
=> K_M = 45,8 µM

c. Calcul de l'activité spécifique (A.S.)

V_Max = 13,7 µM.min^-1 = 13,7 µmoles.min^-1.L^-1 = 13,7 unités.L^-1

Du fait de l'unité choisie pour la concentration, le volume est 1 litre de milieu réactionnel. Or, la réaction s'effectue dans un volume réél de 10 mL.
=> V_Max = 0,137 unités dans 10 mL = 0,137 U.tube^-1

d. Expression de [E₀]

On met 0,2 mL de solution d'enzyme à une concentration initiale de 10 mg.mL^-1 dans un volume total de 10 mL.
=> [E₀] = 0,2 (mL) x 10 (mg.mL^-1) = 2 mg dans 10 mL = 2 mg.tube^-1

Les unités de V_Max et de [E₀] sont cohérentes et les valeurs tiennent compte du volume réactionnel réel.

L'activité spécifique est donc : A.S. = V_Max/[E₀] = (0,137 unités.tube^-1) / (2 mg.tube^-1) = 68,5 mU.mg^-1