Demarche experimentale obtention vitesse initiale Cinetique enzymatique a deux substrats Cours Enzymologie Licence Angers Emmanuel Jaspard biochimej

Système à 2 substrats - Fixation au hasard : Représentation en double inverses

Démarche expérimentale pour la détermination des vitesses initiales à l'origine des graphes primaires

Voir le cours sur les réactions enzymatiques à 2 (ou plus) substrats.

1. Variation de la concentration du substrat A

Une première série de mesures est effectuée pour une gamme de concentration initiale du substrat A (de [A₀]₁ à [A₀]_n), chaque tube contenant une première concentration fixe du substrat B ([B₀]₁).
Une deuxième série de mesures est effectuée pour une gamme de concentration initiale du substrat A (de [A₀]₁ à [A₀]_n), chaque tube contenant une deuxième concentration fixe du substrat B ([B₀]₂).
...
Une nième série de mesures est effectuée pour une gamme de concentration initiale du substrat A (de [A₀]₁ à [A₀]_n), chaque tube contenant une nième concentration fixe du substrat B ([B₀]_n).

vitesses initiales	concentrations variables de A
vitesses initiales	[A₀]₁	[A₀]₂	...	[A₀]_n
1ère série : [B₀]₁fixe	v_i1¹	v_i2¹	...	v_in¹
2ème série : [B₀]₂fixe	v_i1²	v_i2²	...	v_in²
...	...	...	...	...
nième série : [B₀]_nfixe	v_i1ⁿ	v_i2ⁿ	...	v_inⁿ
Pour chaque concentration fixe en substrat B, on obtient une courbe de saturation en fonction de la concentration du substrat A.

L'équation de la courbe de saturation pour [A₀] = [A₀]₁ à [A₀]_n et une concentration fixe [B₀]_xs'écrit :

                                                       [A₀]
v_i^[B0]x=V_max . ---------------------------------------
                                             K_B                              α K_B
                       [α K_A . ( 1 + ----- )] + [[A₀] . ( 1 + ----- )
                                            [B₀]_x                            [B₀]_x

L'équation de la droite des double inverses s'écrit :

1 α K_A K_B 1 1 α K_B
------ = [------- . ( 1 + ----- )] . ----- + [ ------ . ( 1 + ------ )
v_i^[B0]x V_max [B₀]_x [A₀] V_max [B₀]_x

Elle est de la forme :

1 1
------ = f [ ----- ]
v_i^[B0]x [A₀]

Voir la représentation des doubles inverses : graphe ou représentation primaire pour A

Chaque droite a pour ordonnée à l'origine :

1 1 α K_B
--------- = ------ . ( 1 + ------ )
V_max^[B0]x V_max [B₀]_x

L'ensemble des droites se coupent en un point dont l'ordonnée à l'origine est :

1 1
------- = ------ . ( 1 - α)
v_i^[B0]x V_max

Le point d'intersection avec l'axe des abcisses pour [B₀] = 0 est :

   1               1
----- = - ----
^[B₀^]₀            K_B

On détermine ainsi la constante de dissociation de B de l'enzyme libre.

Le point d'intersection avec l'axe des abcisses pour [B₀] -> infini est :

1 1
----- = - -----
^[B₀^]_inf α K_B

2. Variation de la concentration du substrat B

Il n'est pas nécessaire d'effectuer une seconde série de mesures de vitesse initiale pour différentes concentrations de B à [A] fixe. En effet, ces mesures sont déjà obtenues.

Pour les équations et les caractéristiques du graphe primaire pour B, il suffit de permuter les concentrations et les indices A en B et ... réciproquement.

A titre indicatif, la procédure expérimentale serait :

Une première série de mesures est effectuée pour une gamme de concentration initiale du substrat B (de [B₀]₁ à [B₀]_n), chaque tube contenant une première concentration fixe du substrat A ([A₀]₁).
Une deuxième série de mesures est effectuée pour une gamme de concentration initiale du substrat B (de [B₀]₁ à [B₀]_n), chaque tube contenant une deuxième concentration fixe du substrat A ([A₀]₂).
...
Une nième série de mesures est effectuée pour une gamme de concentration initiale du substrat B (de [B₀]₁ à [B₀]_n), chaque tube contenant une nième concentration fixe du substrat A ([A₀]_n).

vitesses initiales	concentrations variables de B
vitesses initiales	[B₀]₁	[B₀]₂	...	[B₀]_n
1ère série : [A₀]₁fixe	v_i1¹	v_i2¹	...	v_in¹
2ème série : [A₀]₂fixe	v_i1²	v_i2²	...	v_in²
...	...	...	...	...
nième série : [A₀]_nfixe	v_i1ⁿ	v_i2ⁿ	...	v_inⁿ
Pour chaque concentration fixe en substrat A, on obtient une courbe de saturation en fonction de la concentration du substrat B.

Voir le graphe ou représentation primaire pour B;