1. Introduction et définitions

2a. Système séquentiel (ou à simple déplacement) appelé au hasard

2b. Démarche expérimentale pour la détermination des vitesses initiales

3. Système séquentiel (ou à simple déplacement) appelé ordonné

4. Détail du mécanisme séquentiel ordonné de l'acyltransférase LpxD

5. Système à double déplacement appelé Ping Pong

6. Mécanismes d'inhibition des systèmes à 2 substrats

a. Inhibition par les analogues de substrats

b. Inhibition par les produits des réactions

7. Mécanismes plus complexes

a. Pas de complexe central ou isomèrisation de l'enzyme

b. Enzymes avec plus de 2 substrats / plus de 2 produits

c. Etude de la protéine kinase FAK-1

8. Utilisation d'isotopes pour distinguer les mécanismes : échange isotopique et effets des isotopes

9. Cas des protéases à sérine

10. Liens Internet et références bibliographiques

1. Introduction et définitions

Nous faisons l'hypothèse de l'établissement rapide des différents équilibres de fixation entre l'enzyme et les substrats :

• C'est l'hypothèse du quasi-équilibre (l'étape de catalyse étant l'étape limitante). L'approche du quasi-équilibre est plus simple pour l'établissement de l'équation de la vitesse.
• Cette hypothèse est justifiée pour les systèmes appelés "séquentiels au hasard" et, dans une moindre mesure, pour ceux appelés "séquentiels ordonnés".

Pour ce second type de système, l'hypothèse de l'état stationnaire est préférable (voir "Modèles homéomorphes") :

Cependant, cette approche nécessite une méthode graphique qui permet de représenter la distribution des différents complexes enzymatiques en termes de concentration de substrat et des différentes constantes de vitesse : la méthode de E. King & C. Altman (1956).

De plus, l'équation de la vitesse ainsi obtenue n'est pas encore utilisable telle quelle tant que les constantes de vitesse n'ont pas été exprimées en termes de paramètres cinétiques déterminables expérimentalement (V_M, K_M et K_I).

Il faut alors appliquer les règles générales (ou nomenclatures) développées par Wallace Cleland (1963).

Les mécanismes à plusieurs substrats sont de 3 types :

• Lles mécanismes séquentiels (ou à simple déplacement) qui se subdivisent en mécanisme séquentiel ordonné ou mécanisme séquentiel au hasard.
• Le mécanisme à double déplacement (ou mécanisme Ping Pong).

2. Système séquentiel (ou à simple déplacement) appelé au hasard

Deux substrats, A et B, se fixent de manière aléatoire sur l'enzyme libre E (c'est-à-dire qu'il n'y a pas de fixation privilégiée de l'un ou l'autre des deux substrats) avec une constante de dissociation K_A et K_B, respectivement.

Parfois la fixation de l'un des deux substrats modifie la constante d'équilibre de dissociation de l'autre substrat de l'enzyme libre d'un facteur α. Le mécanisme réactionnel s'écrit :

On aboutit à un ensemble de courbes de saturation pour chaque substrat (voir la démonstration des équations : v_i = f([A₀]) et v_i = f([B₀]).

Représentations graphiques obtenues avec le mécanisme au hasard

Les paramètres : α, K_A et K_B sont déterminés à partir :

• du graphe primaire pour le substrat A
• du graphe primaire pour le substrat B

La description de la démarche expérimentale pour déterminer les vitesses initiales permet de mieux comprendre ces deux types de représentations graphiques.

• Les graphes primaires permettent de déterminer de nouvelles valeurs : voir les équations des droites.
• Ces valeurs sont reportées dans le graphe secondaire pour le substrat A et le graphe secondaire pour le substrat B.
• Elles permettent de déterminer : V_M, K_M^A et K_M^B.

Voir un document qui explique la procédure simple pour tracer les droites des doubles inverses.

Exemples d'enzymes qui ont un mécanisme catalytique au hasard

• La glutathion S-transférase
• Figure ci-dessous : la créatine kinase (E.C. 2.7.3.2). Il s'agit d'un mécanisme Bi Bi au hasard.

Travaux dirigés : voir un exercice corrigé de ce mécanisme.

3. Système séquentiel (ou à simple déplacement) appelé ordonné

Dans un tel système, l'ordre de fixation est obligatoire : le substrat A doit se fixer à l'enzyme libre E avant le substrat B. En d'autres termes, le le substrat B ne peut se fixer qu'au complexe EA. Un complexe ternaire EAB est toujours formé.

Représentations graphiques obtenues avec le mécanisme ordonné

Le paramètre K_A est confondu avec le paramètre K_M^A. Il est (sont) déterminé(s) à partir du graphe primaire pour le substrat A (ci-dessous) :

Les valeurs du graphe primaire pour le substrat A sont reportées dans le graphe secondaire pour le substrat B (ci-dessous) qui permet de déterminer : V_M et K_M^B.

Voir un document qui explique la procédure simple pour tracer les droites des doubles inverses.

Exemples d'enzymes qui ont un mécanisme catalytique ordonné

a. Les déshydrogénases à NAD⁺ : dans le cas de la lactate déshydrogénase (mécanisme Bi Bi ordonné), le coenzyme se fixe toujours en premier et le lactate est toujours relargué en premier.

b. L'adénylate kinase (E.C. 2.7.4.3) catalyse la réaction globale : AMP + ATP <=> 2 ADP selon un mécanisme séquentiel ordonné.

c. Les sirtuines sont des histones désacétylases nictotinamide adénine dinucléotide (NAD⁺)-dépendantes / ADP-ribosyltransférases. Elles couplent l'hydrolyse du NAD⁺ et la désacétylation d'un substrat acétylé pour former la nicotinamide, le produit désacétylé et le nouveau métabolite O-acétyl-ADP-ribose (OAADPR).

Figure ci-dessous : schéma réactionnel des sirtuines 2 qui suivent un mécanisme Bi Ter ordonné.

Source : Borra et al. (2009)

• Le substrat acétylé (Ac-R) doit se fixer en premier, puis le NAD⁺, pour former le complexe ternaire.
• La nicotinamide est le premier produit relargué suivi par une libération au hasard du produit désacétylé et de OAADPR.

d. Mécanisme ordonné des ADN polymérases

Travaux dirigés : voir un exercice corrigé de ce mécanisme.

4. Détail du mécanisme séquentiel ordonné de l'acyltransférase LpxD

Le lipide A (glycolipide phosphorylé) est la partie hydrophobe du lipopolysaccharide qui constitue le feuillet externe de la membrane externe de la plupart des bactéries gram négatives. Le lipide A ancre le lipopolysaccharide dans la membrane externe de la cellule et est généralement nécessaire pour la croissance bactérienne.

La LpxD acyltransférase (UDP-3-O-(3-hydroxymyristoyl)glucosamine N-acyltransférase - EC 2.3.1.191) est la 3ème enzyme de la voie de biosynthèse du lipide A chez Escherichia coli. La LpxD catalyse la N-acylation [R-3-hydroxymyristoyl-ACP]-dépendante de l'UDP-3-O-(R-3-hydroxymyristoyl)-α-D-glucosamine pour former l'UDP-2, 3-diacylglucosamine et l'ACP.

La chaîne acyle R-3-hydroxymyristoyl est portée par l'ACP.

Source : Bartling & Raetz (2008)

Abréviations dans la figure ci-dessus:

• ACP = Acyl Carrier Protein
• R-3-OHC₁₄-ACP = R-3-hydroxymyristoyl-acyl carrier protein
• UDP = Uridine DiPhosphate
• UDP-acyl-GlcN = UDP-3-O-(R-3-OHC₁₄)-GlcN = UDP-3-O-(R-3-hydroxymyristoyl)-α-D-glucosamine
• UDP-2-N-(R-3-OHC₁₄)-GlcN = UDP-2-N-(R-3-hydroxymyristoyl)-α-D-glucosamine
• 4′-PPT = 4 '-phosphopantéthéine

Figure ci-dessous : acyl-ACP intacte.

Source : Masoudi et al. (2013)

L'ACP contient 4 hélices (I à IV) et des boucles (L1 à L3) 28, 29. Le bras 4′-PPT et la chaîne acyle R-3-hydroxymyristoyl sont indiqués. Chaque monomère du trimère de LpxD contient 3 domaines :

Source : Masoudi et al. (2013)

• le domaine N-terminal de fixation de l'uridine (UBD : "Uridine-Binding Domain")
• un domaine central riche en hélices β de pas gauche (LβH : "Left-handed β-Helix domain") qui contient His 239 catalytique (base générale) et Gly 257 (trou oxyanion)
• un domaine C-terminal (CTD)

La zone de reconnaissance (interaction) de l'ACP (ARD : "ACP Recognition Domain") est constitué du domaine C-terminal et de la dernière hélice du domaine LβH.

La LpxD suit un mécanisme Bi Bi ordonné dans lequel :

Source : Bartling & Raetz (2008)

• l'acyl-ACP (R-3-OHC₁₄-ACP) se fixe avant UDP-3-O-(R-3-OHC₁₄)-GlcN
• l'UDP-2, 3-diacylglucosamine se dissocie avant l'holo-ACP (la forme de l'enzyme dont la chaîne acyle s'est libérée)

Explication structurale de ce mécanisme

Source : Masoudi et al. (2013)

Figure a : l'acyl-ACP se fixe en premier à la forme libre de LpxD, formant le complexe binaire (EA - figure b).

Figure b : l'ACP est associée à l'ARD ("ACP recognition domain") et le groupe acyle 4 '-phosphopantéthéine (4′-PPT), lié à Ser 36, est empaqueté dans un canal hydrophobe.

Figure c : l'UDP-acyl-GlcN se fixe ensuite ce qui initie le transfert du groupe acyle.

Figure d : au sein du complexe ternaire, le bras de 4′-PPT issu de l'hydrolyse de l'acyl-ACP (ligne ondulée orange transparente) englobe complètement la chambre catalytique, ce qui empêche l'UDP-diacyl-GlcN de se dissocier. Le déplacement de 4′-PPT (ligne ondulée orange foncée) vers Met290 (flèche en pointillés) ouvre la chambre catalytique.

Figure e : ce mouvement entraîne la sortie éventuelle de l'UDP-diacyl-GlcN.

Figure f : ce mouvement déclenche des changements conformationnels en aval de l'hélice II conduisant à une dissociation de l'holo-ACP.

Travaux dirigés : voir un exercice corrigé de ce mécanisme.

5. Système à double déplacement appelé "Ping Pong"

Un ou plusieurs produits est/sont relargué(s) avant que tous les substrats ne soient fixés à l'enzyme. Ce mécanisme est caractérisé par la formation obligatoire d'une forme intermédiaire modifiée de l'enzyme (E*) qui est un acyl-enzyme.

Exemples d'enzymes

• les aminotransférases : mécanisme Bi Bi Ping Pong (figure ci-dessous)

• certaines oxydo-réductases (exemples : thioredoxine réductase, 3'-phosphoadénosine-5'-phosphosulfate réductase)
• certaines transférases (exemple : acylneuraminate-cytidylyl transférase)
• certaines protéases de la cascade de coagulation du sang
• certaines protéases à sérine (figure ci-dessous)

Modèle cinétique du mécanisme "Ping-Pong"

Le mécanisme réactionnel s'écrit :

Ce mécanisme est caractérisé par un ensemble de droites parallèles selon la représentation en double - inverses :

Travaux dirigés : voir un exercice corrigé de ce mécanisme.

Mécanisme "Ping Pong" à 2 sites (ou plus)

La transcarboxylase (EC 2.1.3.1) catalyse un mécanisme appelé Ping Pong à 2 sites ("two-site Ping Pong mechanism"). D'autres enzymes catalysent des mécanismes ping pong à n sites.

Ces enzymes contiennent des coenzymes (exemples : biotine, acide lipoïque, 4-phosphopantétheine) liés par covalence. Ces coenzymes transfèrent d'un site à l'autre les groupements modifiés lors de la réaction enzymatique.

Le transfert du groupe carboxyle est médié par la biotine qui peut passer d'un site à l'autre. En effet, la biotine est covalamment liée à la transcarboxylase via une liaison amide entre le groupe pentanoyl de la biotine et le groupe aminobutyl d'une lysine de l'enzyme.

Sur un site : le méthyl-malonyl-CoA transfère son groupe carboxyle à la biotine pour former la carboxy-biotine-transcarboxylase et le propionyl-CoA est dissocié de l'enzyme.

Sur l'autre site : le pyruvate se fixe indépendamment. La carboxy-biotine y est transférée et le pyruvate est carboxylé en oxaloacétate qui se dissocie de l'enzyme.

Les équations des vitesses sont identiques au mécanisme Ping Pong classique mais les profils d'inhibitions sont inversés.

6. Mécanismes d'inhibition des systèmes à 2 substrats

Voir un cours sur les inhibitions des réactions enzymatiques.

b. Inhibition par les produits des réactions

α. Règles générales

• L'étude de l'effet inhibiteur de l'un des produits est faite en absence de l'autre produit : la formation réverse des substrats ne peut pas avoir lieu.
• Le produit ajouté se fixant à l'enzyme libre et/ou à l'enzyme complexée à l'un des substrats, il diminue la vitesse de la réaction comme le ferait un analogue de substrat.
• Cette diminution a lieu aussi bien aux faibles qu'aux fortes concentrations en substrat : c'est alors un effet inhibiteur non compétitif.
• Cet effet disparaît à faible concentration en substrat si la forme de l'enzyme sur laquelle se fixe le substrat et la forme de l'enzyme sur laquelle se fixe le produit sont séparées par des étapes irréversibles : le produit se comporte alors comme un inhibiteur classique.
• Une étape qui implique la fixation d'un substrat ou d'un produit peut être rendue irréversible si on travaille à très fortes concentrations en substrat ou en absence du produit.

β. Fixation au hasard - hypothèse du quasi-équilibre pour les substrats et les produits.

Aucun produit ne peut, seul, favoriser la réaction réverse car, en absence de l'autre produit, le complexe EPQ ne peut pas se former. Les produits se comportent donc comme des analogues de substrat.

Il y a 4 types d'inhibition qui dépendent de l'aptitude des 2 produits à se fixer en même temps que les 2 substrats :

• la fixation d'un produit est exclusive de celle d'un des substrats : il y a au moins 2 inhibitions compétitives
• si un produit empêche la fixation des 2 substrats, il y a 3 inhibitions compétitives et 1 inhibition non compétitive

γ. Fixation ordonnée - hypothèse du quasi-équilibre pour les substrats et les produits

E + A <=> EA + B <=> EAB <=> EPQ <=> EQ + P <=> E + Q

Le produit Q est un inhibiteur compétitif :

• vis-à-vis du substrat A : sa fixation est exclusive de celle de A
• vis-à-vis du substrat B : l'étape : la réaction E + A <=> EA étant en quasi-équilibre, l'excès de B déplace la réaction EQ <===> E + Q vers Q, ce qui empêche la fixation de Q

Le produit P :

• n'a pas d'effet inhibiteur car EQ n'existe pas en absence de Q
• mais si le produit P peut se fixer sur EA, alors le produit P se comporte comme un analogue de B : inhibition incompétitive vis-à-vis de A et compétitive vis-à-vis de B

δ. Fixation ordonnée - hypothèse de l'état stationnaire

Le produit Q est :

• un inhibiteur compétitif vis-à-vis du substrat A
• un inhibiteur non compétitif vis-à-vis du substrat B : la forme de l'enzyme sur laquelle se fixe B (EA) et celle sur laquelle se fixe Q (E) sont séparées par une étape réversible

Le produit P :

• est un inhibiteur non compétitif vis-à-vis des substrats A et B : la forme E sur laquelle se fixe A et le complexe EA sur lequel se fixe B sont séparés du complexe EQ (sur lequel se fixe P) par des étapes réversibles
• pour de très fortes concentrations de B, l'étape EA + B <=> EAB devient irréversible et le produit P se comporte alors comme un inhibiteur incompétitif vis-à-vis du substrat A (pas d'inhibition à faible concentration de A)

ε. Mécanisme Ping Pong

E + A <=> EA <=> E'P <=> E' + P
E' + B <=> E'B <=> EQ <=> E + Q

En présence d'un des produits de la réaction, les étapes de fixation des deux substrats ne sont plus séparées par des étapes irréversibles : les droites dans les graphes primaires ne sont plus parallèles.

Le produit P est :

• un inhibiteur non compétitif vis-à-vis du substrat A : la forme E sur laquelle se fixe A et la forme E' sur laquelle se fixe P sont séparés par des étapes réversibles
• un inhibiteur compétitif vis-à-vis du substrat B : leurs fixations sont exclusives

Le produit Q est :

• un inhibiteur compétitif vis-à-vis du substrat A
• un inhibiteur non compétitif vis-à-vis du substrat B

Source : Viratelle O. (1993) "Protéines et enzymes - TD" - Collection Méthodes, Hermann - ISBN : 2-7056-6185-9

7. Mécanismes plus complexes

a. Pas de complexe central ou isomèrisation de l'enzyme

Mécanisme séquentiel Theorell - Chance (exemple : histone acétyltransférase p300) : le complexe central ne s'accumule pas car les substrats s'associent faiblement avec l'enzyme. En conséquence, la concentration à l'état stationnaire du complexe central est négligeable du point de vue cinétique.

Exemple de mécanisme Iso Bi Bi Ordonné où l'enzyme libre s'isomèrise (forme E en forme F).

b. Enzymes avec plus de 2 substrats / plus de 2 produits

Exemples d'enzymes qui catalysent des réactions avec 3 substrats et 2 ou 3 produits : glutamine synthétase adenylyltransferase (EC 2.7.7.42); les aminoacyl tRNA synthétases (EC 6.1.1.*); l'acétyl-CoA synthétase (EC 6.2.1.1); la succinyl-CoA synthétase (EC 6.2.1.5); les mono-oxygénases.

Exemple de mécanisme Ter Uni Uni Ping Pong de la pyruvate phosphate dikinase (EC 2.7.9.1). Cette enzyme est utilisée par les plantes en C4.

Autres exemples de mécanismes avec plus de 2 substrats / plus de 2 produits

a. Le complexe multi-enzymatique mitochondrial α-cétoglutarate deshydrogénase (EC 1.2.4.2, EC 2.3.1.61 et EC 1.6.4.3) est un élément clé de la régulation du cycle de Krebs.

• Ce complexe catalyse la réaction : α-cétoglutarate + CoA-SH + NAD⁺ + H₂O <=> succinyl-CoA + CO₃^2- + NADH + H⁺
• Cette réaction a été analysée via un mécanisme catalytique sophistiqué Ter Ter.

b. Figure ci-dessous :

• Mécanisme Ter Bi Ordonné catalysé par la glutamate deshydrogénase à NADP⁺ (EC 1.4.1.3).
• Mécanisme Ter Ter catalysé par l'aspartate-ammonia ligase (EC 6.3.1.1 - asparagine synthétase).

Exemples d'enzymes avec 4 substrats et 3 ou 4 produits

• β-hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (E.C. 1.1.1.34) : (R)-mevalonate + CoASH + 2 NADP⁺ <=> (S)-3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA + 2 NADPH
• Nitrite reductase (E.C. 1.7.1.4) : NO₂^- + 3 NAD(P)⁺ + 2 H₂0 <=> nitrite + 3 NAD(P)H
• Carbamoyl phosphate synthase (ammonia) (E.C. 6.3.4.16) : 2 ATP + HC0₃^- + NH₄⁺ <=> 2 ADP + carbamoylphosphate + phosphate
• NAD⁺ synthase (glutamine-hydrolyzing) (E.C. 6.3.5.1) : ATP + deamido-NAD⁺ + L-glutamine + H₂0 <=> AMP + pyrophosphate + NAD⁺ + L-glutamate
• GMP synthase (glutamine-hydrolyzing) (E.C. 6.3.5.2) : ATP + xanthosine 5'-phosphate + L-glutamine + H₂0 <=> AMP + pyrophosphate + GMP + L-glutamate
• Asparagine synthase (glutamine-hydrolyzing) (E.C. 6.3.5.4) : ATP + L-Asp + L-Gln + H₂O <=> AMP + diphosphate + L-Asn + L-Glu
• Pyruvate carboxylase (E.C. 6.4.1.1) : ATP + pyruvate + HC0₃ + biotine <=> ADP + phosphate + oxaloacetate + biotine

Ci-dessous : les 3 mécanismes ordonnés Ter Bi.

Voir l'article de W. Cleland (1963).

c. Etude de la protéine kinase FAK-1 - Schneck et al. (2010)

FAK-1 : "Focal Adhesion Kinase-1" est une protéine kinase (tyrosine kinase non-récepteur) ubiquitaire dans toutes les cellules.

Méthode de mesure des vitesses de catalyse : mesures de la radioactivité incorporée lors de la phosphorylation d'un substrat synthétique, le peptide Ac-RRRRRRSETDDYAEIID-NH₂ (Y est le site de phosphorylation) appelé FAK-tide.

FAK-1 est un homodimère (2 x 119 kDa). Son domaine catalytique contient un motif SH2, flanqué d'un domaine N-terminal FERM et d'un domaine C-terminal contenant la séquence de ciblage pour l'adhésion focale ("Focal Adhesion Targeting" - FAT).

Sous sa forme inactive, le domaine FERM relie les extrémités des lobes N- et C-terminaux du domaine kinase et s'étend au travers du site actif, bloquant ainsi l'accès au substrat, donc la catalyse.

La séquence du peptide FAK-tide correspond donc à la séquence du site d'autophosphorylation de FAK-1 (autophosphorylation de Tyr₃₉₇) : Tyr₃₉₇ n'est pas située dans la boucle d'activation mais dans une région qui relie domaine FERM et le domaine catalytique.

L'ensemble des résultats sont en faveur d'un mécanisme Bi-Bi au hasard (figure ci-dessous).

• Les étapes de formation et de dissociation de tous les complexes binaires devraient être beaucoup plus rapides que la catalyse : les constantes de vitessse k₁, k₂, k₇, k₈, et les constantes k₁₉ à k₂₇ sont plus élevées que k₁₃.
• Les formes enzymatiques marquées d'une astérisque indiquent des étapes correspondant à un changement de conformation qui entraîne l'activation d'une boucle fermée.

Source : Schneck et al. (2010)

EAB* et EPQ* : E-MgATP-FAK-tide et E-MgADP-phospho-FAK-tide, respectivement, avec la boucle d'activation fermée

EPQ : E-MgADP-phospho-FAK-tide avec la boucle d'activation ouverte

L'étape de catalyse (k_cat) est limitante à cause de deux évènements lents (encadré du bas de la figure ci-dessus) :

• le transfert réversible du groupement phosphoryle (k_aller ≈ 0.2 s^-1 et k_retour ≈ 0.04 s^-1)
• un processus conformationnel lent (k_{conformationnel} ≈ 0.1 s^-1) qui correspond sans doute à l'ouverture de la boucle d'activation après le transfert du groupement phosphoryle, mais avant la libération du produit

8. Utilisation d'isotopes pour distinguer les mécanismes : échange isotopique et effets des isotopes

Voir un cours sur la radioactivité.

Les hypothèses sur lesquelles reposent l'échange isotopique et les effets des isotopes ne peuvent pas être vraies simultanément d'où la nécessité d'ajuster les conditions expérimentales pour étudier l'un ou l'autre de ces deux processus.

a. Etude de l'échange isotopique

L'hypothèse élémentaire est que la substitution d'un isotope par un autre n'a pas d'effet sur les propriétés chimiques et que les effets sur les propriétés cinétiques sont négligeables.

Le schéma ci-dessous représente le transfert d'un atome radioactif (représenté par une astérisque) de A* à P* dans un mécanisme ordonné.

Cet échange d'atomes requière que A* se fixe à E : il ne peut donc avoir lieu que s'il y a une concentration suffisante de E. La réaction d'échange doit donc être inhibée par de fortes concentrations de A ou de Q puisqu'ils sont en compétition avec A* pour E.

Les effets de B et P sont plus subtils :

• d'une part, la réaction d'échange inclue la fixation de B sur EA* et dès lors une concentration finie de B est nécessaire.
• d'autre part, si B et P sont présents à de très fortes concentrations, l'enzyme est très largement sous forme de complexe ternaire (EAB + EPQ) : il n'y a donc pas de forme E sur laquelle pourrait se fixer A. En conséquence, de fortes concentrations de B et P inhibent cet échange.

Deux équations en fonction des concentrations [EA*] et [EA*B] avec l'hypothèse de l'état stationnaire :

• d[EA*]/dt = k₁[A*][E] - (k_-1 + k₂[B]) . [EA*] + k_-2[EA*B] = 0
• d[EA*B]/dt = k₂[B][EA*] - (k_-2 + k₃) . [EA*B] + k_-3[P*][EQ] = 0

Pour [P*] => 0 (condition de vitesse initiale) : [EA*B] = k₁.k₂[A*][B][E] / k_-1.(k_-2 + k₃) + (k₂.k₃[B])

La vitesse initiale d'échange isotopique s'écrit : v_i* = k₃.[EA*B] = k₁.k₂.k₃[A*][B][E] / k_-1.(k_-2 + k₃) + (k₂.k₃[B])

Expression de [E]

Le traitement de l'équation ci-dessus est simplifié si on fait l'hypothèse que les concentrations des substrats non marqués ne sont pas modifiées par la présence de traces de substrats radioactifs. De la même manière la concentration [E] est la même que s'il n'y avait pas de substrats radioactifs.

Il y a deux manières de s'affranchir d'une expression complexe de [E] :

Soit la vitesse d'échange isotopique est étudiée avec les réactions impliquant le substrat non marqués à l'équilibre :
[E] = [E₀] / [1 + (k₁[A]/k_-1) + (k₁.k₂[A][B] / k_-1.k_-2) + (k₁.k₂.k₃[A][B][P] / k_-1.k_-2.k_-3)]

Soit on ne prend pas en compte les vitesses d'échange isotopique mais le rapport de ces vitesses d'échange.

b. Etude des effets des isotopes

A l'inverse de l'échange isotopique, l'hypothèse est qu'il y a une différence de propriétés à l'équilibre et de cinétiques entre les isotopes. L'utilisation d'isotopes permet, entre autre, de distinguer divers mécanismes enzymatiques.

L'énergie de la liaison C-H en fonction de la distance séparant les deux atomes ne dépend que du nuage électronique qui les entoure et cette énergie est la même pour tous les isotopes de C et de H. Cependant, quand une liaison vibre, les niveaux d'énergies de cette liaison dépendent des masses des atomes en vibration : en conséquence, ces niveaux d'énergies sont différents pour des isotopes différents.

• L'effet isotopique cinétique (primaire et secondaire) est l'effet sur le rapport [constante de vitesse de fixation de l'isotope léger / constante de vitesse de fixation de l'isotope lourd]. La disponibilité du deutérium (²H ou D) et du tritium (³H) s'avère précieuse pour l'étude des effets de la substitution isotopique sur la cinétique des réactions enzymatiques. En effet, leur différence de masse avec ¹H permet la mesure de différences importantes entre les vitesses des réactions avec l'isotope léger et l'isotope lourd.

• L'effet isotopique d'équilibre (dépendant de la température) est l'effet sur le rapport [constante d'équilibre de fixation de l'isotope léger / constante d'équilibre de fixation de l'isotope lourd].

• L'effet isotopique d'équilibre est en général moins important que l'effet isotopique cinétique.

Il existe plusieurs méthodes pour étudier les effets des isotopes :

a. La comparaison des représentations réciproques avec des substrats non marqués et marqués :

• Le rapport des pentes reflète l'effet isotopique sur [V_Max / K_M].
• Le rapport des points d'intersection avec l'axe des ordonnées reflète l'effet isotopique sur V_Max. C'est la seule façon de déterminer les effets isotopiques sur V_Max mais elle est limitée à des effets isotopiques d'au moins 5%.

b. La "compétition interne" où les substrats non marqués et marqués sont présents en même temps. Le changement dans leur proportion reflète l'effet isotopique sur [V_Max / K_M] du substrat marqué. Cette méthode est utilisée avec ³H ou ¹⁴C ou avec l'abondance naturelle de ¹³C, ¹⁵N et ¹⁸O.

c. L'étude des perturbations de l'équilibre quand un substrat marqué et le produit correspondant non marqué sont présents à l'équilibre.