1. Présentation générale

a. Les métabolites secondaires
b. Recherche et découverte d'antibiotiques et d'antifongiques
c. Classifications des métabolites secondaires

2. Aperçu général des voies du métabolisme secondaire

3. Les polycétides ("polyketides")

4. Les polycétides synthétases (PKS)

5. Mécanisme des polycétides synthétases de type I

6. Les peptides non ribosomiques ("Non-ribosomal peptides")

7. Les synthétases de peptides non ribosomiques ("Non-Ribosomal Peptide Synthetases" - NRPS)

8. Composés aromatiques - Composés phénoliques

a. Les phénylpropanoïdes
b. Les flavonoïdes

9. Liens Internet et références bibliographiques

1. Présentation générale

a. Les métabolites secondaires

Les métabolites primaires (métabolisme primaire) sont associés aux fonctions vitales pour la cellule : aucun organisme ne peut vivre sans la glycolyse ou une voie métabolique équivalente.

Ensemble de cours sur le métabolisme primaire.

Les métabolites secondaires (aussi appelés produits naturels) sont des molécules organiques non directement impliquées dans le développement ou la reproduction d'un organisme. Leur absence n'entraîne pas une mort immédiate mais peut limiter la survie, la fécondité ou l'apparence d'un organisme. Cette absence peut aussi n'avoir aucun effet.

Les métabolites secondaires ont essentiellement pour rôle d'accroître la compétitivité de l'organisme qui les biosynthétise : les métabolites secondaires lui procure un avantage sur d'autres organismes.

Malgré tout, les métabolites secondaires ont des fonctions biologiques qui peuvent s'avérer essentiels. Exemples:

• les pigments isoprénoïdes et les parfums (isoprénoïdes volatils) des plantes attirent les insectes pollinisateurs (essentiels pour la reproduction)
• moyens de défense contre des agressions d'origines biotiques et abiotiques
• communication entre plantes, micro-organismes ou animaux (hormones, phéromones, ...)

Les métabolites secondaires sont souvent spécifiques d'une espèce. Exemples : les bactéries (Actinomyces, Streptomyces, ...), les champignons filamenteux (Penicillium, ...), les éponges marines (Invertébrés), ...

Les plantes produisent plus de 200.000 métabolites secondaires ou spécialisés (produits bio-actifs naturels).

Exemples de précurseurs de produits industriels ou pharmaceutiques synthétisés par des micro-organismes modifiés

• Introduction de fragments d'ADN de 36.000 paires de bases codant pour 20 enzymes et/ou protéines impliquées dans le catabolisme d'alginate pour la production de bio-carburant à partir d'algues.
• Dérivés d'intérêt pharmaceutique :
  1. L'anti-oxydant naringenine (produite par Escherichia coli)
  2. L'anti-cholestérol lovastatine, précurseur de la simvastatine (produite par Aspergillus terrus)
  3. production par Saccharomyces cerevisiae de l'acide artemisinique (terpenoide), précurseur de l'artémisinine utilisée contre la malaria
• Synthèse de butanediols.
• Le 1,3-propanediol est naturellement produit pas certaines bactéries lors de la fermentation du glycérol. Il est utilisé pour la synthèse de poly-methylène térephthalate (vendu sous le nom déposé "Soron" par DuPont).
• La diamine putrescine, utilisée pour la synthèse du nylon 4,6, a été produite par Escherichia coli après déletion d'un gène (rpoS) codant un facteur de transcription impliqué dans la réponse au stress.
• Synthèse des monomères 3-hydroxypropionate et 3-hydroxybuyrate et synthèse de leurs polymères et co-polymères respectifs.
• Synthèse des polymères bactériens poly-hydroxy-alkanoates.

b. Recherche et découverte d'antibiotiques et d'antifongiques

L'utilisation généralisée d'antibiotiques à partir des années 1940 (notamment la pénicilline - découverte en 1928 et la streptomycine - découverte en 1943) a transformé la médecine en fournissant des remèdes efficaces contre les maladies les plus fréquentes de l'époque.

Les antibiotiques naturels ont évolué afin de rompre les barrières qui empêchent la pénétration dans les bactéries cibles et la plupart des antibiotiques introduits en médecine ont été découverts à partir de microorganismes du sol cultivables.

Cependant, le développement de résistances limite la durée de vie utile des antibiotiques et exige de découvrir en permanence de nouveaux composés. Mais la découverte de médicaments anti-microbiens est d'une rare difficulté, principalement en raison de la faible pénétration des composés dans les bactéries.

La surexploitation de cette ressource limitée dans les années 1960 a mis fin à la découverte d'antibiotiques et ce d'autant que les approches par synthèse chimique n'ont pas pu remplacer les antibiotiques naturels.

Source : Lewis K. (2012)

Début 2015, des chercheurs ont annoncé que la teixobactine (isolée de la bactérie Eleftheria terrae) est le premier membre d'une nouvelle classe d'inhibiteurs de la synthèse de peptidoglycanes.

Source : Ling et al. (2015)

La teixobactine se fixe à la région undecaprenyle-PP-sucre de deux cibles précurseurs différentes : le lipide II (précurseur du peptidoglycane) et le lipide III (précurseur de l'acide téichoïque).

La teixobactine est très puissante contre une large gamme de bactéries Gram-positif, y compris Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline et les entérocoques résistants à la vancomycine.

Source : Ling et al. (2015)

• Les domaines catalytiques de la NRPS qui synthétisent la teixobactine sont : A, adénylation; C, condensation; MT, méthylation de Phe; T, thiolation; TE, thioestérase (cyclisation Ile-Thr).
• La N-méthylation de la première Phe est catalysée par le domaine méthyltransférase du module 1. La cyclisation entre la dernière Ile et Thr est catalysée par les domaines thioestérase pendant le relarguage de la molécule.

La paroi de toutes les bactéries contient un polymère de sucres aminés alternés : la N-acétylglucosamine (GlcNAc) et l'acide N-acétylmuramique (MurNAc) - figure ci-dessous - partie a en haut.

Ces polymères de glycanes sont réticulées par un pentapeptide dont la séquence est généralement [L-Ala-γ-D-Glu-diaminopimelyl (ou L-Lys) -D-Ala-D-Ala] attaché au sucre MurNAc. Cette réticulation confère à la cellule sa rigidité et sa résistance mécanique.

Source : Breukink & Kruijff (2006)

Le lipide II (plusieurs milliers de molécules par cellule bactérienne) est le transporteur d'isoprénoides C₅₅ qui reçoit le muramyl-pentapeptide à la fin de la phase qui a lieu dans le cytoplasme de la biosynthèse du peptidoglycane (figure ci-dessus - partie a en bas ).

Tout en restant sur la face interne de la membrane cytoplasmique, le muramyl-pentapeptidyl-lipide II est glycosylé. Puis le disaccharyl-pentapeptidyl-lipide II est transloqué par des flippases sur la face externe de la membrane cytoplasmique.

Lorsqu'elle affleure à la surface externe de la membrane, la partie lipide II du disaccharyl-pentapeptidyl-lipide II est la cible de 2 types d'antibiotiques :

• Les antibiotiques glycopeptidiques de la famille de la vancomycine qui interagissent avec l'extrémité D-Ala-D-Ala. La vancomycine est le premier antibiotique glycopeptidique découvert (isolé de la bactérie Amycolatopsis orientalis en 1956).
• Les antibiotiques tels que la nisine (conservateur alimentaire) se fixent à la région pyrophosphate du lipide II.

Nouveaux antibiotiques contre les bactéries Gram-

La darobactine est un nouvel antibiotique produit par un opéron silencieux de Photorhabdus khanii (synthèse ribosomale). Il semble actif contre les bactéries Gram- in vitro (exemples : Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginos, Acinetobacter baumannii, …) et chez des modèles d'infection animale.

• La darobactine a une structure inhabituelle avec 2 anneaux fusionnés formés après la traduction.
• La darobactine se fixe à BamA, le facteur d'assemblage des protéines de la membrane externe : la membrane ne peut pas se former correctement, tuant ainsi l'hôte.

Une famille d'antibiotiques peptido-mimétiques chimériques (murepavadine et polymyxine B1) qui possèdent une activité antimicrobienne à large spectre contre les bactéries à Gram- a également été découverte. Ces antibiotiques ont un mécanisme d'action qui implique également la liaison au LPS et à BamA.

Voir Imai et al. (2019) & Luther et al. (2019).

Nouvel antibiotique contre une bactérie Gram+

Des macrolides appelés séquanamycines sont des inhibiteurs exceptionnels (in vitro et in vivo) du ribosome de Mycobacterium tuberculosis.

Les séquanamycines interagissent avec le ribosome de la même manière que l'érythromycine et la clarithromycine (des macrolides également). Cependant, les caractéristiques de liaison des séquanamycines surmontent la résistance aux macrolides de Mycobacterium tuberculosis.

L'obtention de structures tridimensionnelles des séquanamycines fixés au ribosome ont permis de les optimiser et d'obtenir une molécule appelée SEQ-9 :

• Cette molécule est efficace seule dans des modèles murins de tuberculose aiguë et chronique. Elle possède une activité bactéricide dans un modèle murin d'infection tuberculeuse en association avec d'autres médicaments antituberculeux.
• Elle est donc un excellent candidat clinique pour lutter contre la tuberculose sensible et résistante aux médicaments.

Source : Zhang et al. (2023)

Recherche de nouveaux antibiotiques par intelligence artificielle

Un réseau de neurones a été créé pour apprendre à reconnaître les particularités structurales des molécules qui inhibent la croissance d'Escherichia coli en utilisant une collection de 2335 molécules à activité anti-bactérienne connue, dont environ 300 antibiotiques et 800 produits naturels d'origine végétale, animale et microbienne (Stokes et al., 2020).

Le modèle construit a ensuite été utilisé pour analyser plus de 100 millions de molécules de la bibliothèque "Drug Repurposing Hub" (entre autres molécules, cette bibliothèque contient environ 6000 molécules à l'étude pour des maladies chez l'homme) : environ 100 molécules candidates ont été sélectionnées pour des tests.

Une molécule (étudiée pour un éventuel traitement du diabète) s'est avérée un antibiotique puissant : l'halicine ("c-Jun N-terminal kinase inhibitor", SU3327), dénommée ainsi d'après HAL (l'ordinateur du film "2001: A Space Odyssey").

• L'halicine possède des activités antibiotiques contre un large éventail d'agents pathogènes, notamment une souche de Clostridioides difficile et une souche d'Acinetobacter baumannii "pan-résistante" contre laquelle de nouveaux antibiotiques sont nécessaires de toute urgence.
• Les antibiotiques agissent via divers mécanismes (par exemple, le blocage des enzymes impliquées dans la biosynthèse de la paroi cellulaire, la réparation de l'ADN ou la synthèse des protéines). Cependant, le mécanisme de l'halicine n'est pas conventionnel : il perturbe le flux de protons à travers la membrane cellulaire.

Puis plus de 107 millions de structures de molécules de la base de données ZINC15 (base de données gratuite de près d'un milliard de composés disponibles dans le commerce pour le criblage virtuel) ont été analysées : 23 molécules candidates ont été testées et 8 molécules ont une une activité antibactérienne. En particulier, deux d'entre elles ont une activité contre un large éventail d'agents pathogènes et contre des souches d'Escherichia coli résistantes aux antibiotiques.

Recherche de nouveaux antifongiques par combinaison d'algorithme et d'analyse bioinformatique de génomes

Le décryptage de la voie des stérols a permis de développer des médicaments tels que les statines hypo-cholestérolémiantes et les azoles antifongiques.

• Les azoles tels que le fluconazole et le kétoconazole inhibent la lanostérol 14α-déméthylase (CYP51), un cytochrome P450 qui catalyse la première étape de la biosynthèse de l'ergostérol.
• La restricticine 1 est un polycétide tétrahydropyrane glyciné susceptible d'inhiber CYP51 par coordination de l'amine libre avec le fer de l'hème.

Penicillium restrictum fabrique la restricticine pour se défendre contre d'autres champignons (exemple, Candida albicans). Cet antifongique bloque une enzyme cruciale de ces champignons adverses et freine ainsi leur croissance.

Tout champignon qui fabrique de la restricticine doit se protéger de cette molécule : le gène fongique qui code cet antifongique se trouve à proximité du gène codant un variant de son enzyme cible résistant à la restricticine.

Le développement d'un algorithme d'exploration du génome pour rechercher des gènes codant pour une enzyme résistante à proximité de groupes de gènes susceptibles de synthétiser la restricticine a permis de découvrir la voie de biosynthèse de cet antifongique (synthétisé également chez d'autres espèces de champignons).

Source : Liu et al. (2021)

c. Classifications des métabolites secondaires

On estime à plusieurs centaines de milliers les métabolites secondaires, de structure et de fonction très diverses. Il existe donc un grand nombre de classification selon les sources.

Il ressort que la classification la plus élémentaire des métabolites secondaires inclue trois groupes :

• les terpènes (par exemple : les substances volatiles des plantes, les glycosides, les caroténoïdes, les stérols, ...)
• les composés phénoliques (par exemple : les acides phénoliques, les coumarines, les lignanes, les stilbènes, les flavonoïdes, les tanins, la lignine, ...)
• les composés contenant de l'azote (par exemple : les alcaloïdes, les glucosinolates, ...)

L'une des classifications les plus fiables et exhaustives est celle de KEGG qui s'appuie sur de très nombreuses informations (en particulier les voies de biosynthèse) concernant les produits naturels.

2. Aperçu général des voies du métabolisme secondaire

En terme de complexité le métabolisme secondaire n'a de "secondaire" que le nom. Et ce d'autant plus que l'ensemble des molécules précurseurs du métabolisme secondaire sont issues du métabolisme primaire.

Figure ci-dessous : exemple simplifié de l'extrême complexité de la synthèse d'un métabolite secondaire. Les enzymes et la plupart des molécules connexes aux réactions ne sont pas indiquées.

La distinction métabolisme primaire versus métabolisme secondaire n'est pas formelle.

La partie métabolisme secondaire implique un très grand nombre de réactions. Notamment celles catalysées par le complexe multi-fonctionnel polycétide synthase : construction cyclique de l'armature pour la fin de la synthèse de la rifamycine B.

Le plus étonnant est la transformation des métabolites du point de vue structural et donc chimique :

• le métabolite de départ est un ose modifié
• certains métabolites clés intermédiaires sont des cycles aromatiques simples : kanosamine et acide 3-amino-5-hydroxybenzoique (3,5-AHBA)
• le métabolite final (la rifamycine B) est une structure très complexe : antibiotique de la classe "Ansamycins and related polyketides"

Les rifamycines (classification "Ansamycins and related polyketides") forment un groupe d'antibiotiques synthétisés par la bactérie Amycolatopsis rifamycinica. Ils sont une sous-classe de la famille des ansamycines.

Voies du métabolisme secondaire

Voir la carte générale du métabolisme secondaire.

Les liens dans le tableau ci-dessous renvoient vers des fichiers ou des cartes interactives du métabolisme (exemple ci-dessous).

Ces liens permettent d'obtenir des informations sur les métabolites, les enzymes et les gènes codant ces enzymes qui sont impliqués dans chaque réaction d'une voie métabolique considérée.

3. Les polycétides ("polyketides")

Ils constituent l'une des classes majeures de métabolites secondaires des bactéries, des champignons et des végétaux.

Leur biosynthèse présente des analogies avec la biosynthèse des acides gras : ils sont synthétisés par une succesion d'étapes de condensation de groupes acétyle ou malonyle.

Les complexes enzymatiques qui catalysent ces réactions sont les polycétides synthétases.

Les polycétides forment une grande famille de produits naturels (métabolites secondaires) synthétisés par les bactéries, les champignons et les plantes.

Il existe une remarquable diversité de polycétides, tant en termes de structures que de fonctions.

Ils possèdent une très large gamme d'activités pharmacologiques (antimicrobiens, antifongiques, antiparasitaires, anti-tumoraux) et agrochimiques.

Source des fichiers cdxml : LIPID Metabolites and Pathways Strategy (LIPID MAPS)

En particulier, les polycétides incluent de nombreux médicaments importants tels que :

• des antibiotiques (tétracycline, érythromycine, rifamycine - famille des ansamycines, ...)
• des hypocholestérolémiants (lovastatine)
• des anticancéreux (daunorubicine - famille des anthracyclines)
• des immuno-suppresseurs (rapamycine, ciclosporine ...)
• des agents vermifuges (avermectine)
• et bien d'autres composés ...

Les cyclosporines sont un groupe de macrolides isolés à partir de champignons.

Classification : "Polyketides : Non-ribosomal peptide/polyketide hybrids".

La ciclosporine A a été initialement isolée à partir de Tolypocladium inflatum (Hans Frey - 1969 - Norvège). C'est un peptide non ribosomique cyclique de 11 acides aminés (undécapeptide). Il contient un acide aminé de configuration D (dextrogyre) rarement rencontré dans la nature.

La ciclosporine A est un immunosuppresseur (J.F. Borel - 1976) puissant avec une action spécifique sur les lymphocytes T.

L'érythromycine est un antibiotique utile dans le traitement d'un certain nombre d'infections bactériennes. L'érythromycine a un spectre antimicrobien à peu près semblable à celui de la pénicilline.

Classification : "Macrolides and lactone polyketides".

L'actinomycine D (ou dactinomycine) est le plus important membre des actinomycines, classe d'antibiotiques polypeptidiques isolés de bactéries du genre Streptomyces.

L'actinomycine D inhibe la transcription en se fixant au complexe d'initiation de la transcription, empêchant ainsi l'élongation de la chaîne d'ARN par l'ARN polymérase.

Classification : "Non-ribosomal peptide/polyketide hybrids".

La bléomycine est un antibiotique polypeptidique isolé de bactéries du genre Streptomyces. La bléomycine rompt les brins d'ADN.

La bléomycine méga-synthétase est constituée d'une synthétase de peptides non ribosomiques et de modules de polycétide synthétase de type I (voir ci-dessous). Voir : K.M. Fisch (2013).

Classification : "Non-ribosomal peptide/polyketide hybrids".

• Nystatine (Streptomyces noursei) : antifongique.
• Amphotéricine B : (Streptomyces nodosus) : antifongique.
• Oxytétracycline (Streptomyces rimosus) : antibiotique.

Doxycycline (dérivé de l'oxytétracycline - Streptomyces rimosus) : antibiotique.

Monensine A (Streptomyces cinnamonensis) : antibiotique (ionophore).

Rabelomycine - Chalcograne.

• Groupe des aflatoxines (Aspergillus flavus et Aspergillus parasiticus) : mycotoxines.
• Pelargonidine (voir les anthocyanidines) : pigments.
• Roténone (Lonchocarpus nicou) : pesticide, insecticide.

Source des fichiers cdxml : LIPID Metabolites and Pathways Strategy (LIPID MAPS)

Le resvératrol (3,4′,5-trihydroxy-trans-stilbene) est un polycétide aromatique. C'est une phytoalexine (polyphénols de la classe des stilbènes) que l'on trouve dans de nombreuses plantes supérieures (notamment le raisin, l'arachide, la rhubarbe, …).

Il augmente l'expression d'un microARN (miR-663) dans les cellules immunitaires humaines, diminuant ainsi l'expression du microARN miR-155 qui favorise la réaction inflammatoire.

Figure ci-dessous : différents activateurs de la sirtuine 1.

Le resvératrol a un effet cardioprotecteur en inhibant l'agrégation des plaquettes et en atténuant l'expression de la P-selectine 35. Cet effet serait lié à la diminution de l'activité de la phospholipase C.

Le resvératrol neutralise les radicaux libres (et autres oxydants) et inhibe l'oxydation des lipoprotéines LDL.

4. Les polycétides synthétases (PKS)

Les polycétides sont biosynthétisés à partir de précurseurs acyl-CoA par les polycétides synthétases ("Polyketides Synthases" - PKS).

L'étape clé de leur biosynthèse est une condensation décarboxylante analogue à l'étape d'allongement des chaînes au cours de la biosynthèse des acides gras.

Cependant, contrairement à la biosynthèse des acides gras au cours de laquelle chaque étape d'élongation de la chaîne est suivie d'une séquence fixe de réactions (céto-réduction, déshydratation et réduction du groupe énoyle), les différents intermédiaires de l'allongement des chaînes des polycétides subissent toutes, certaines ou aucune de ces modifications de groupes fonctionnels.

Il en résulte un degré de complexité chimique remarquable de ces produits naturels. Un degré de complexité supplémentaire est atteint du fait :

• de l'utilisation de différents types d'unités d'initiation et d'élongation des chaînes des polycétides
• de la synthèse de nouveaux stéréoisomères

Les 3 types de PKS

Les PKS de type I sont des enzymes multi-fonctionnelles organisées en modules : chaque module assure un ensemble distinct d'activités enzymatiques non-itératives responsables de la catalyse d'un cycle d'allongement des chaînes des polycétides.

Elles utilisent la protéine "Acyl Carrier Protein" (ACP) pour activer les substrats acyl-CoA et canaliser la croissance des chaînes de polycétides.

Source : B. Shen (2003)

Exemple : la 6-désoxy-érythromycine B synthétase ("6-deoxyerythromycin B synthase" - DEBS) pour la biosynthèse de polycétides réduits (c'est à dire les macrolides, les polyéthers et le polyène) tels que l'érythromycine A.

Les acronymes des domaines : AT : Acyl-Transferase / ACP : Acyl Carrier Protein / KS : Keto-Synthase / KR : Keto-Reductase / DH : DeHydratase

Les PKS de type II (aussi appelées "bacterial aromatic PKS") sont des complexes multi-enzymatiques qui catalysent de manière itérative un ensemble unique de réactions.

Source : B. Shen (2003)

Les domaines minimaux requis des PKS de type II (mais aussi des PKS de type I) pour effectuer un tour de condensation décarboxylante sont : KS - AT - ACP.

Elles contiennent des domaines catalytiques similaires à ceux des PKS de type I, à ceci près qu'il y a deux domaines KS : KS_α et KS_β. Le premier est équivalent au domaine KS des PKS de type I. Le second contrôle la longueur du polycétide. La réduction des groupes β-cétone n'a lieu qu'après la synthèse complète du polycétide.

Elles sont impliquées dans la synthèse des polycétides aromatiques (souvent polycycliques).

Exemples : la tétracénomycine PKS pour la biosynthèse de la tétracénomycine C - les PKS impliquées dans la synthèse de la partie aglycone de l'actinorhodine et de la daunorubicine.

Les PKS de type III (aussi appelées "chalcone synthase-like PKS") sont des enzymes homodimèriques.

Source : B. Shen (2003)

Comme les PKS de type I et de type II, les PKS de type III (exemple : la chalcone synthase) condensent de manière itérative une unité de démarrage avec une série d'unités d'extension pour générer une chaîne poly-β-cétone.

Mais, à la différence des deux autres types, les PKS de type III :

• ne possèdent pas plusieurs domaines catalytiques.
• suivent un mécanisme indépendant de l'ACP : une seule enzyme utilise les thioesters acyl-CoA et catalyse le transfert du groupe acyle du CoA sur une cystéine du site actif.

Exemples :

• la PKS DpgA génère le précurseur hydraté du thioester dihydroxy-phényl-acétyl pendant la biosynthèse de la 3,5-dihydroxy-phényl-glycine lors de la production de la vancomycine (Amycolatopsis orientalis - antibiotique).
• la synthase RppA pour la biosynthèse de polycétides aromatiques (souvent monocycliques ou bicycliques) comme la flavoline.

Malgré des différences structurales et mécanistiques, les 3 types de PKS catalysent la biosynthèse des polycétides par condensation décarboxylante séquentielle des précurseurs acyl-CoA.

Le domaine céto-acyl synthétase (voir ci-dessous) des PKS de type I ou la sous-unité céto-acyl synthétase des PKS de type II et de type III catalysent l'étape de formation de la liaison C-C.

5. Mécanisme des polycétides synthétases de type I

Les PKS de type I sont des enzymes multi-fonctionnelles organisées en modules séparés par de courtes régions.

L'ordre des modules de l'extrémité N-terminale vers C-terminale est :

• modules de démarrage ou de chargement : AT-ACP-
• modules d'élongation de la chaîne : -KS-AT-[DH-ER-KR]-ACP-
• module de terminaison ou de relarguage : -TE

Source : Salomon et al. (2004)

Les acronymes des domaines:

KS : Keto-Synthase / AT : Acyl-Transferase / ACP : Acyl Carrier Protein
DH : DeHydratase / KR : Keto-Reductase / ER : Enoyl-Reductase
TE : Thio-Esterase / MT : Methyl-Transferase / SH : SulfHydrolase

La chaîne de polycétide et les groupes de démarrage sont liés via leur groupe fonctionnel carboxyle au groupe SH de l'ACP et de KS (liaison thioester).

La chaîne en croissance est transférée d'un groupe thiol à un autre par trans-acylation et elle est libérée par hydrolyse ou par cyclisation.

Les différents intermédiaires de l'allongement des chaînes des polycétides subissent toutes, certaines ou aucune de ces modifications de groupes fonctionnels.

Le coenzyme A ou CoA ou CoASH est la molécule qui permet les réactions de transfert des groupes acyles (R-C=O). Ces groupes sont liés au coenzyme A par des liaisons thioester, liaisons à haut potentiel énergétique (ΔG°' = - 9 kcal/mol).

Le coenzyme A est un dérivé de l'acide pantoténique, vitamine de la famille des vitamines B.

Remarque : l'adénosine 3', 5' -diphosphate n'est pas à confondre avec l'ADP = adénosine 5' -diphosphate.

Le complexe multi-enzymatique (et multi co-facteurs) de la pyruvate déshydrogénase (ou pyruvate:NADP+ oxidoréductase ou PDH - EC 1.2.1.51) catalyse la transformation du pyruvate en acétyl-CoA.

Phase de démarrage

Le groupe de démarrage, généralement l'acétyl-CoA ou le malonyl-CoA, est chargé sur le domaine ACP du module de démarrage.

Cette réaction est catalysée par le domaine AT (Acyl-Transferase) du module de démarrage.

Etapes d'allongement de la chaîne

Figure adaptée de Staunton & Weissman (2001)

La chaîne de polycétide est transférée du domaine ACP du module précédent au domaine KS (Keto-Synthase) du module en cours. Cette réaction est catalysée par le domaine KS.

Le groupe d'élongation, généralement le malonyl-CoA ou le méthyl-malonyl-CoA, est chargé sur le domaine ACP du module en cours. Cette réaction est catalysée par le domaine AT (Acyl-Transferase) en cours.

Le groupe d'allongement lié à l'ACP réagit via une condensation de Claisen avec la chaîne de polycétide fixée au domaine KS (dégagement de CO₂) : le domaine KS est libéré et la chaîne de polycétide en cours d'allongement est fixée à l'ACP. La réaction a lieu à l'extrémité de la chaîne fixée au domaine KS : la chaîne se déplace d'une position et le groupe d'allongement devient le nouveau groupe fixé.

Eventuellement, la chaîne de polycétide en cours d'allongement peut être modifiée pas à pas par des domaines supplémentaires :

• le domaine KR (Keto-Reductase) réduit le groupe β-cétone en groupe β-hydroxy
• le domaine DH (DeHydratase) libère H₂O ce qui entraîne la formation de l'alcène α-β-insaturé
• le domaine RE (Enoyl-Reductase) réduit la double liaison α-β en liaison simple

Ce cycle est répété pour chaque module d'allongement.

Etape de terminaison

Le domaine TE (Thio-Esterase) hydrolyse la chaîne de polycétide complète du domaine ACP du module précédent.

Unités d'extension ("extender units")

Les unités d'extension les plus couramment sélectionnées sont celles liées au CoA : malonyl-CoA, (2S)-méthylmalonyl-CoA, (2S)-éthylmalonyl-CoA et chloroéthylmalonyl-CoA.

Source : Chan & Thomas (2010)

Les unités d'extension liées à l'ACP sont moins courantes : (2R)-méthoxymalonyl-ACP, (2R)-hydroxymalonyl-ACP et (2S)-aminomalonyl-ACP. Elles sont synthétisées sur le bras phosphopantéthéinyl d'une ACP séparée de la ligne d'assemblage PKS.

La protéine porteuse d'acyle ("Acyl Carrier Protein " - ACP)

L'ACP intervient dans la biosynthèse des acides gras et des polycétides. La chaîne en cours de croissance est liée sous forme d'un thiol-ester au groupement thiol distal de la 4'-phosphopantéthéine.

L'ACP est biosynthètisée sous forme apo inactive. La 4'-phosphopantéthéine est ajoutée de manière post-traductionnelle à la sérine 36 conservée de l'ACP, réaction catalysée par la protéine holo-ACP synthase (transférase de groupe phosphopantéthéinyle).

CoA-(4'-phosphopantéthéine) + apo-[ACP] ===> adénosine 3',5'-bis-phosphate + holo-[ACP]

6. Les peptides non ribosomiques ("Non-ribosomal peptides" - NRP)

Les peptides non ribosomiques (NRP) sont une classe majeure de métabolites secondaires peptididiques, généralement synthétisés par des bactéries et des champignons.

Ils sont synthétisés par des synthétases de peptides non ribosomiques ("non-ribosomal peptide synthetases") : cette synthèse est donc indépendante d'un ARN messager. Chaque synthétase ne peut synthétiser qu'un seul type de peptide.

Remarque : certaines cyanobactéries biosynthétisent des peptides avec des ribosomes et les modifient post-traductionnellement (exemples : NRP de la famille des patellamides, NRP de la famille des microviridines).

Exemples de NRP

Les pyrrolamides (congocidine, distamycine, anthramycine, kikumycines, pyrronamycines, noformycine, ...) constituent une famille de NRP synthétisés par Streptomyces ou d'autres actinobactéries (par exemple, Streptomyces ambofaciens pour la production industrielle de la spiramycine).

Cette famille de pyrrole-amides (aussi appelées oligopyrroles ou oligopeptides) contient un ou plusieurs groupes pyrrole-2-carboxamides. Ils se fixent de manière réversible sur des séquences spécifiques (quatre ou plus paires [A-T] consécutives) du petit sillon de la double hélice d'ADN.

• La congocidine (ou netropsine ou sinanomycine) et la distamycine sont des antibiotiques et des antiviraux. Les traits hachurés rouges séparent les précurseurs supposés.
• La tallimustine est un dérivé acide benzoïque de la distamycine.
• L'anthramycine (pyrrolo-benzodiazepine) est spécifique des régions riches en GC.

La surfactine (synthétisée par Bacillus subtilis) appartient à la classe des lipopeptides. Elle est couramment utilisée comme antibiotique.

C'est aussi un agent tensio-actif très puissant utilisé dans certaines applications biotechnologiques. Sa bioactivité est fortement influencée par la partie acides gras.

La surfactine est une lipo-heptapeptide lactone cyclique qui contient 2 acides aminés acides (Glu et Asp) à côté de 5 acides aminés non polaires et 1 acide gras 3-hydroxy. Il existe plusieurs variants de la surfactine. La liaison lactone est surlignée en bleu.

Source : Kraas et al. (2010)

La chaîne de la partie acide gras est variable en longueur (13 à 15 carbones) et en ramification de la chaîne.

Source : PubChem

Autres exemples de NRP

Dipeptides cycliques, indigoidine, andrimide, moiramide, salinosporamide K, orphamide A, solonamides et dérivés, holomycine, skyllamycine, holomycine, saframycine, laspartomycine, thiomarinols, ...

Les depsipeptides sont des peptides au sein desquels un ou plusieurs groupe(s) amide [-C(O)NH-R] est/sont remplacé(s) par un groupe ester [-C(O)O-R]. Exemples :

• kahalalides, étamycine, romidepsine, ...
• divers actinomycètes (protéobactéries marines) produisent des peptides non ribosomiques structurallement et biosynthétiquement liés qui appartiennent à la famille des chromo-depsipeptides. Ces composés agissent comme intercalants dans l'ADN. Ils ont des bioactivités antitumorales, antiparasitaires, antibactériennes et antivirales.

NRP biosynthétisés par les cyanobactéries :

• inhibiteurs de protéases à serine : anabaeno-peptilides (famille des cyanopeptolines des depsipeptides), aeruginosines, ...
• peptides biosynthétisés par des ribosomes et modifiés post-traductionnellement : famille des patellamides, famille des microviridines

7. Les synthétases de peptides non ribosomiques ("Non-Ribosomal Peptide Synthetases" - NRPS)

La biosynthèse des peptides non ribosomiques a des caractéristiques communes avec celle des polycétides. Du fait de ces similitudes structurales et mécanistiques, certaines NRPS contiennent des modules de PKS (par exemple, pour l'insertion de sous-unités dérivées de l'acétate ou du propionate dans la chaîne peptidique).

Les mécanismes de synthèse par les NRPS utilisent plus de 300 acides aminés distincts (incluant des acides aminés D ou N-méthylés).

Les peptides synthétisés par les NRPS n'excédent pas 50 acides aminés.

Comme les PKS, les NRPS de type I sont structurées en modules constitués eux-mêmes de domaines qui possèdent des activités enzymatiques spécifiques.

Les domaines sont séparés par des espaceurs d'une quinzaine d'acides aminés.

Un module minimum est constitué des domaines : C - A - PCP - TE.

Le domaine A (environ 550 acides aminés - IPR010071)

Il catalyse l'activation de l'acide aminé (figure ci-dessous) :

• le domaine A est dans une conformation ouverte afin que les substrats (l'acide aminé et ATP-Mg2+) se fixent. Il y a formation d'un intermédiaire aminoacyl-adénylate (conformation fermée).
• l'acide aminé activé est transféré au domaine PCP (formation d'une liaison thioester avec le cofacteur 4'-phospho-pantéthéine de PCP). Le domaine A retourne dans une conformation ouverte.

Le domaine A peut catalyser cette activation sans être relié à d'autres domaines.

Le domaine PCP (environ 90 acides aminés) : une sérine conservée fixe le cofacteur 4'-phophopantétheine (forme apo => forme holo).

Le domaine C (environ 450 acides aminés) ajoute les acides aminés via une réaction de condensation. Sa structure permet aux domaines PCP qui entourent le domaine C de positionner les substrats pour la condensation.

Le domaine TE (environ 250 acides aminés) libère le produit peptidique par hydrolyse ou macro-cyclisation.

Illustration de la très grande dynamique des domaines des NRPS

Voir une vidéo (source : Reimer et al., 2016) : animation du cycle de synthèse du module d'initiation de la gramicidine A synthétase linéaire (LgrA)

Source : Reimer et al. (2016)

• Le processus d'assemblage commence par la fixation de l'ATP et de la valine à une conformation ouverte du domaine A . Ce domaine se referme (rotation d'environ 30°) pour catalyser l'adénylation de la valine.
• Le domaine A tourne de 140° pour catalyser le transfert de la valine sur le groupement thiol du bras phosphopantétheine (PPE) du domaine PCP.
• Le domaine PCP transporte la valine sur une distance de 50 Å entre les sites actifs des domaines A et F pour fixer un groupe formyle.
• Le domaine PCP déplace ensuite la formyl-valine au module d'élongation. Le domaine PCP est libéré et peut participer à une autre série de réactions.

Les structures observées expérimentalement sont annotées par des valeurs statistiques cristallographiques (parties désordonnées ou parties absentes en gris). Les détails de l'adénylate au sein du domaine A et de la valine dans le site actif (réaction de formylation) sont basés sur les co-complexes de domaines A et A-PCP et de protéines FT (voir la vidéo).

Exemple de l'entérobactine synthétase

Figure ci-dessous : biosynthèse de l'entérobactine (chélateur du fer - siderophore) de Escherichia coli catalysée par deux modules de l'entérobactine synthétase (EC 6.3.2.14) qui correspond aux 4 protéines : EntD, EntE, EntB et EntF.

Source : Pfennig & Stubbs (2012)

Réaction globale : 6 ATP + 3 L-serine + 3 2,3-dihydroxybenzoate <=> 6 AMP + enterobactine + 6 diphosphate + 3 H+

• DHB : acide 2,3-dihydroxybenzoique
• produit final relargué : enterobactine macrolactone trimerique (DHB-Ser)₃ - depsipeptide linéaire

EntD (phosphopantétheinyl transférase) active EntB.

EntE catalyse la condensation (ATP-dépendante) du 2,3-dihydroxybenzoate et de holo-EntB pour former forme arylée de EntB.

EntB est bifonctionnelle :

• l'extrémité N-terminale porte l'activité isochorismate lyase (isochorismate + H₂O => pyruvate + 2,3-dihydroxy-2,3-dihydrobenzoate)
• l'extrémité C-terminale correspond au domaine PCP

EntF est une protéine constituées de quatre domaines qui catalyse :

• l'activation de la L-sérine par l'ATP
• la condensation de la L-sérine activée avec le 2,3-dihydroxybenzoate activé
• la trimérisation de trois [sérine / 2,3-dihydroxybenzoate] en entérobactine

Exemples d'autres NRPS et de leur produit

• pénicilline G (Penicillium chrysogenum) : antibiotique / NRPS δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine synthétase (3 modules)
• pyoverdine (Pseudomonas aeruginosa) : peptide sidérophore fluorescent/ NRPS PvdL
• tyrocidine : antibiotique décapeptide cyclique / NRPS TycA (32 domaines)
• cryptophycines : groupe de depsi-peptides de cyanobactéries / NRPS CDPH-M2

Il existe aussi des NRPS de type II constituées d'enzymes indépendantes ("standalone enzymes") :

BlmI : synthèse de la bléomycine (Streptomyces verticillus ATCC 15003)
SgcC2 : synthèse d'antibiotiques ènediynes C-1027 (Streptoalloteichus sp. ATCC 53650)
MdpC : synthèse de la maduropeptine (Actinomadura madurae ATCC 39144)

8. Composés aromatiques - Composés phénoliques

Cette famille contient des composés non azotés qui possèdent des cycles aromatiques, sous forme de glycoconjugués. Ils sont en général solubles dans l'eau.

Exemples : acide salicylique, isoflavones, des composés d'huiles essentielles (en association avec des terpènes), les tannins, la lignine (polymère formé à partir de dérivés de l'acide cinnamique).

Les composés phénoliques des végétaux (plus de 8.000 structures) sont principalement dérivés de la voie des phénylpropanoides et de la voie de l'acétate. Ils représentent 40 % du carbone organique qui circule dans la biosphère. Ils ont des rôles dans les structures de la paroi cellulaire, les défenses des plantes, les caractéristiques du bois et des écorces, la couleur des fleurs, les saveurs ...

Les composés phénoliques synthétisés et accumulés par certaines plantes (exemple : la chicorée industrielle - Cichorium intybus, Asteraceae) sont les antioxydants alimentaires les plus abondants. La chicorée industrielle produit et accumule l'acide chlorogénique, l'acide isochlorogénique, l'acide caftarique et l'acide chicorique (esters de caféoyle).

• Voir les travaux de l'équipe "Métabolisme Secondaire et Stress Abiotiques des Végétaux" - Université Lille Nord de France.
• Voir le détail des composés phyto-chimiques - base de données KEGG.

a. Les phénylpropanoïdes

Ils dérivent de la phénylalanine, constituent l'essentiel des composés aromatiques.

Source : T. Vogt (2010)

• un précurseur issu de la glycolyse : le phosphoénolpyruvate
• un précurseur issu de la voie des pentoses phosphate : l'érythrose-4-phosphate.

Il s'ensuit une voie commune qui aboutit à la formation du shikimate puis du chorismate.

La phénylalanine ammonia-lyase (PAL - EC 4.3.1.24) et la tyrosine ammonia-lyase (TAL - EC 4.3.1.23) catalysent la désamination non-oxydative de Phe en acide trans-cinnamique et orientent le flux de carbone de la voie du shikimate vers les diverses branches du métabolisme général des phenylpropanoïdes.

Le 4-coumaroyl CoA est un métabolite carrefour clé dans la biosynthèse des phénylpropanoïdes chez les plantes. Il est le précurseur direct des flavonoïdes ou des lignines ou participe à la biosynthèse de monolignols.

Une étape décisive est contrôlée par l'enzyme hydroxycinnamoyl CoA:shikimate / quinate hydroxy-cinnamoyl transférase (HCT).

b. Les flavonoïdes

Ce sont des métabolites secondaires synthétisés par les plantes. Ce sont des pigments qui assurent de nombreuses fonctions chez les plantes. Leurs rôles physiologiques (antioxydant, antibactérien, , ...) sont très variés.

Exemples de flavones (anthoxanthine) naturelles : apigenine, luteoline, tangeritin, chrysine, baicalein, wogonine.

On trouve un très grand nombre de flavonols (anthoxanthine) dans les fruits et les légumes (exemples : azaleatine, fisetine, galangine, kaempferide, kaempferol, morine, myricetine, pachypodol, rhamnetine).

Le squelette de base des flavonoïdes peut subir un grand nombre de modifications : hydroxylation, glycosylation, prénylation, méthylation, acétylation.

Voir la voie de biosynthèse des flavones et des flavonols.

Découverte de l'interférence ARN

En 1990, Napoli, Lemieux & Jorgensen ont été les premiers à décrire un phénomène d'interférence ARN, sans savoir qu'il s'agissait de ce mécanisme.

L'objectif de leur étude était de déterminer si la chalcone synthase (CHS), une enzyme clé de la biosynthèse des flavonoïdes, est l'enzyme limitante dans la voie de biosynthèse de l'anthocyane à l'origine de la coloration violette profonde du pétunia.

Les anthocyanes sont des pigments hydrosolubles vacuolaires rouges, violets ou bleus selon le pH. Ils appartiennent aux flavonoïdes synthétisées par la voie des phénylpropanoïdes.

Les anthocyanes dérivent des anthocyanidines par addition d'oses (sur R3).

Napoli, Lemieux & Jorgensen ont surexprimé la CHS en introduisant dans des pétunias un transgène codant une CHS exogène : étonnament, 42% des pétunias dans lesquels le gène CHS a été introduit, ont blanchi (seulement 9% des fleurs contrôle ont blanchi).

Le niveau de [CHS endogène + CHS introduite] était 50 fois inférieur au niveau de CHS du pétunia de type sauvage. Ca a été la première mise en évidence du phénomène d'interférence ARN.

Biosynthèse des anthocyanidines : cyanidine, pélargonidine et delphinidine.

Source : Falcone Ferreyra et al. (2012)
Fleurs de gauche à droite: Chrysanthemum morifolium, Gentiana scabra, Calendula officianalis, Ipomoea quamochit, Gentiana triflora et Evolvulus pilosus.

Enzymes :

• CHS, Chalcone synthase
• CHI, chalcone isomerase
• PN, flavone synthase
• F3H, flavonoïde-3-hydroxylase
• F3′H, flavonoïde-3′-hydroxylase
• F3′5′H, flavonoïde 3′, 5′-hydroxylase
• FLS, flavonol synthase
• DFR, dihydroflavonol 4-réductase
• ANS, anthocyanidine synthase