| Titration spectrophotométrique des résidus tyrosines au sein d'une protéine |
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Analyser les courbes de titration de 3 protéines différentes (A, B et C).
Combien de tyrosines contiennent ces protéines ? Quel est le pKa d'ionisation de ces tyrosines ? En déduire la localisation des tyrosines dans la structure tridimensionnelle de ces protéines. |
| Cours sur les acides aminés | Synthèse de la tyrosine |
| Phosphorylation de la tyrosine | Sulfatation de la tyrosine |
| La valeur du pKa d'ionisation du groupement phénol des Tyr dépend de leur environnement. |
| Protéine | A | B | C | ||
| Tyr titrées | 5 | 2 | 3 | 2 | 3 |
| pKa | 9,8 | 9,8 | apparent : 11,75 | 9,8 | apparent : de 10 à 12 |
| localisation | en surface donc accessibles au solvant | en surface | complètement enfouie | en surface | de la surface au coeur |
| Voir un exercice sur la titration d'un acide aminé. | |||||
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L'aspect abrupt de la 2è partie de la courbe de transition de la protéine B ne traduit pas la titration de 3 Tyr. Elle reflète la perte brutale de la structure de la protéine dûe au pH très basique : la protéine est dénaturée et les 3 Tyr sont exposées ensemble au solvant. Le groupement phénol des Tyr s'ionise en ion phénolate avec un pKa = 10,1 à 10,5.
Cette ionisation induit :
En conséquence : à pH > 11, c'est essentiellement l'absorbance des Tyr (selon leur nombre et leur accessibilité) que l'on mesure quand on mesure l'absorbance à 295 nm. Les échelles ne sont pas identiques dans la figure ci-dessous.
Le spectre d'absorbance de Trp est représenté à l'échelle 1, celui de Tyr a été multiplié par 2, celui de Cys par 4 et celui de Phe par 20. En conséquence : à pH7, c'est essentiellement l'absorbance des Trp (selon leur nombre et leur accessibilité) que l'on mesure quand on enregistre le spectre d'absorbance d'une protéine ou que l'on mesure directement l'absorbance à 280 nm. |
| Acide aminé ou liaison | λmax absorbance | εM (M-1.cm-1) |
| Tyr (Y) | 273 - à 277 nm / épaulement à 283 nm | 1280 à 1440 |
| Trp (W) | 282 nm | 5050 à 5690 |
| Phe (F) | 3 pics majeurs : 254 nm - 262 nm - 267 nm | 200 à 220 |
| Cys (C) | de 240 à 280 (bande large) | 120 |
| liaison peptidique | 190 à 230 nm | ----- |
| Liens Internet et références bibliographiques |
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"Proteins, Peptides & Amino Acids" "Tyrosine metabolism" |
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| Jaspard E. (2000) "Role of protein-solvent interactions in refolding: effects of cosolvent additives on the renaturation of porcine pancreatic elastase at various pHs" Arch. Biochem. Biophys. 375, 220 - 228 | Article |
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