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L'encapsidation de phages in
vitro utilise un système bactérien mis au point par
Rosenberg et coll. (1985, 1987) :
- En conséquence, les particules de phage
qui se développent dans la bactérie hôte n'ont pour
origine que les phages recombinants qui ont transfecté cette
bactérie et non pas les phages préalablement contenus
dans le lysat. Ces derniers ont pour rôle de fournir le matériel
génétique minimal pour la multiplication des phages recombinants
et leur encapsidation.
- De plus, la souche E. coli C est particulière
car son génome ne code pas le système des enzymes de restriction
de la famille E. coli K-12 (EcoK).
a.
Encapsidation
- 5 µl de chaque milieu de ligation (environ 0,5
µg d'ADN de phage recombinant) ont été ajoutés
à 50 µl de milieu d'encapsidation de phage (système " Packagene®",
Promega, France) et incubés à 22°C pendant 3 heures.
- Puis 445 µL de tampon de phage (Tris-HCl 20
mM, pH 7,4 ; NaCl 100 mM ; MgSO4 10 mM) et 25 µL
de chloroforme sont ajoutés au mélange d'encapsidation.
Les phages recombinants empaquetés
sont conservées à -70°C après supplémentation
en DMSO 7% et en gélatine 0,01%.
- Un contrôle de l'efficacité de
l'encapsidation est effectué en encapsidant le phage λ
cI857 Sam7 (déjà circularisé et sans
insert) dans les mêmes conditions.
- L'efficacité de ces étapes a
été évaluée par une amplification PCR des
milieux d'empaquetage en utilisant le couple d'amorce GDH (ensemble
d'oligonucléotides dégénérés issus
de l'alignement de séquences de glutamate déshydrogénase EC 1.4.1.2 et 1.4.1.3) et le couple d'amorce spécifique du phage
λ
gt11.
b.
Bibliographie
- Rosenberg S. M., Stahl M. M. , Kobayashi I.
& Stahl F.W. (1985) "Improved in vitro packaging of coliphage
lambda DNA : a one-strain system free from endogenous phage"
Gene 38, 165 - 175
- Rosenberg S. M. (1987) "Improved in vitro
packaging of lambda DNA" Methods Enzymol. 153, 95 - 103
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