Fixation ADP GTP Glutamate deshydrogenase ligand proteine Scatchard Travaux diriges Enseignement et recherche Biochimie Universite Angers Emmanuel Jaspard biochimej

Fixation de l'ADP et/ou du GTP sur la glutamate déshydrogénase

Voir une description de l'expérience de la dialyse à l'équilibre

1. Fixation de l'ADP sur la glutamate déshydrogénase

nu = ([ADP]lié / [GDH]tot) - Exp. 1 & 2	[ADP]libre - Expérience 1 (µM)	[ADP]libre - Expérience 2 (µM)
1.2	0.65	2.5
2.4	1.75	6.6
3.6	3.92	16.7
4.2	6.08	23.3
4.8	10.4	40
5.4	42.2	90

y = (nu / [ADP]libre) - Expérience 1 (µM^-1 )	y = (nu / [ADP]libre) - Expérience 2 (µM^-1 )
1.85	0.48
1.37	0.364
0.918	0.216
0.691	0.18
0.462	0.12
0.128	0.06

ADP GTP glutamate deshydrogenase fixation ligand proteine Scatchard dehydrogenase dialyse equilibre biochimej

2. Fixation du GTP sur la glutamate déshydrogénase

nu = ([GTP]lié / [GDH]tot) - Exp. 3 & 4	[GTP]libre - Expérience 3 (µM)	[GTP]libre - Expérience 4 (µM)
0.3	4.3	15.6
0.6	10	35.7
1.2	26	95.2
1.8	60	214
2.4	166	571

y = (nu / [GTP]libre) - Expérience 3 (µM^-1 )	y = (nu / [GTP]libre) - Expérience 4 (µM^-1 )
0.0698	0.0192
0.06	0.0168
0.0462	0.0126
0.03	0.00841
0.0145	0.0042

ADP GTP glutamate deshydrogenase fixation ligand proteine Scatchard dehydrogenase dialyse equilibre biochimej

3. Schéma de la structure de la glutamate déshydrogénase

Le nombre de site déterminé est le même que l'enzyme soit préalablement complexée au second ligand ou non : les sites de fixation de l'ADP et du GTP sont donc distincts.

La GDH est le plus souvent un homohexamère. Elle contient :

6 sites de fixation de l'ADP <=> 1 site de fixation de l'ADP par sous-unité.
3 sites de fixation du GTP <=> la formation d'1 site de fixation du GTP nécessite l'association de deux sous-unités.

La GDH n'est donc fonctionnelle qu'après avoir adopté sa structure quaternaire.

Structure schematique site de fixation glutamate deshydrogenase biochimej

La fixation préalable du second ligand augmente dans les deux cas la valeur de la constante de dissociation, donc diminue celle de la constante d'association. Il y a donc diminution de l'affinité des sites de fixation pour leur ligand respectif quand l'autre ligand est déja fixé.
En conséquence, la fixation d'un ligand induit un changement de conformation de l'enzyme donc un changement de conformation des sites de fixation de l'autre ligand.

Voir un cours sur les déshydrogénases.

Voir allostérie et fixation coopérative.

4. Hypothèse sur le schéma réactionnel de la fixation des deux ligands

Si le schéma correspond à un schéma "carré" (figure ci-dessous), alors le complexe ternaire [ADP - GDH - GTP] est obtenu de manière équivalente que l'ADP se fixe en premier puis le GTP ou l'inverse.

Schema carre de la fixation ADP GTP glutamate deshydrogenase biochimej

Ce schéma est valide puisque les deux valeurs sont identiques :

K_d^{(GDH,
ADP)} x K_d^{(GDH -
ADP, GTP)} = 2,5 µM x 141 µM = 352,5 µM²

K_d^{(GDH,
GTP)} x K_d^{(GDH -
GTP, ADP)} = 38,5 µM x 10 µM = 385 µM²

Jaspard, E. (2006) "Analysis of the structure - function relationship of glutamate dehydrogenase", Biology Direct 1: 38