Interactions protéine - protéine et interactomique - Fluorescence du DAPI et chevauchement des spectres
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Quel sont le nom développé du DAPI et sa structure ?

Le DAPI est le 4',6-diamidino-2-phenylindole.

Source figure : PubChem

interactome protein interaction transfert fluorescence absorption emisssion energie chevauchement spectre DAPI FITC biochimej

Sur quel type d'acide nucléique se fixe-t-il et où ?

Le DAPI est un colorant fluorescent bleu spécifique de l'ADN.

Il se fixe dans les régions riches en AT du petit sillon de l'ADN double brin. Il colore donc préférentiellement le noyau.

Ci-contre : visualisation du DAPI lié à l'ADN à une résolution de 2,40 Å (code PDB : 1D30).

Donner des exemples d'utilisation du DAPI.

En raison de sa forte affinité pour l'ADN, le DAPI est utilisé notamment :

  • Pour trier et compter les cellules en fonction de leur contenu en ADN ("Fluorescence Activated Cell Sorting" - FACS).
  • Pour colorer les chromosomes, analyser l'apoptose, ...
  • Le DAPI peut traverser une membrane cellulaire intacte (à de fortes concentrations) : il est utilisé pour colorer des cellules vivantes ou fixées.
  • C'est donc également un marqueur de la viabilité de la membrane.

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Illustrer les propriétés spectrales du DAPI (émission, excitation, couples [accepteur-donneur], …).

Selon les formes chimiques du DAPI :

  • Sa longueur d'onde maximale d'excitation est à environ 359 nm (spectre violet ci-dessous).
  • Sa longueur d'onde maximale d'émission est à environ 457 nm.

Le DAPI est caractérisé par un large spectre d'émission qui chevauche considérablement certains fluorophores. Les propriétés spectrales du DAPI sont utilisées dans les expériences dites "multicolores" avec :

  • Les fluorophores rouges, par exemple : mCherry, mKate2, Alexa Fluor 594, rhodamine, Texas Red ...
  • Les fluorophores verts, par exemple : la GFP, Alexa Fluor 488, l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) …
  • Figure ci-dessous : les spectres d'émission du DAPI (violet) et du FITC (vert) illustrent le transfert d'énergie important entre 475 et 600 nm.

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Figure adaptée de : AAT Bioquest

Comparaison de chevauchement de spectres

Aller au site Chroma :

  • Avec l'application "Spectra viewer", sélectionner ("Current selection (0 of 15)") les fluorochromes corrects et représenter le chevauchement des spectres [émission DAPI - excitation FITC] entre 350 nm et 600 nm (bouton bleu "update").
  • Idem pour le couple [émission DAPI - excitation GFP].

Interpréter les chevauchements de spectres obtenus.
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