Quel sont le nom développé du DAPI et sa structure ?

Le DAPI est le 4',6-diamidino-2-phenylindole.

Source figure : PubChem

Sur quel type d'acide nucléique se fixe-t-il et où ?

Le DAPI peut traverser les membranes des cellules.

Dans le noyau, il se lie au petit sillon des séquences d'ADN double brin riches en A/T ("A/T-rich double-stranded DNA") et colore ainsi préférentiellement les noyaux.

• La liaison du DAPI à l'ADN double brin induit une augmentation de la fluorescence d'un facteur 20, probablement liée au déplacement de molécules d'eau d'hydratation [DAPI et petit sillon].
• Spectres d'excitation/d'émission du DAPI : lorsqu'il est lié à l'ADN double brin ("dsDNA"), le DAPI a une longueur d'onde d'excitation maximale à 358 nm (UV) et une longueur d'onde d'émission maximale à 461 nm (bleu/cyan).

Ci-contre : visualisation du DAPI lié à l'ADN à une résolution de 2,40 Å (code PDB : 1D30).

Exemples d'utilisation du DAPI

En raison de sa forte affinité pour l'ADN, le DAPI est utilisé notamment :

• Pour trier et compter les cellules en fonction de leur contenu en ADN ("Fluorescence Activated Cell Sorting" - FACS).
• Pour colorer les chromosomes, analyser l'apoptose, ...
• Le DAPI peut traverser une membrane cellulaire intacte (à de fortes concentrations) : il est utilisé pour colorer des cellules vivantes ou fixées.
• C'est donc également un marqueur de la viabilité de la membrane.

Illustration des propriétés spectrales du DAPI et du FITC : émission, excitation, couples [accepteur-donneur], chevauchement de spectres

Selon les formes chimiques du DAPI :

• Sa longueur d'onde d'excitation maximale est 359 nm.
• Sa longueur d'onde d'émission maximale (spectre violet, figure ci-dessous) est 457 nm.

Le DAPI est caractérisé par un large spectre d'émission qui chevauche considérablement les spectres d'excitation de nombreux autres fluorophores. Les propriétés spectrales du DAPI sont donc utilisées dans les expériences dites "multicolores" avec :

• Les fluorophores verts, par exemple : l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), la GFP, Alexa Fluor 488 …
• Les fluorophores rouges, par exemple : mCherry, mKate2, Alexa Fluor 594, rhodamine, Texas Red ...

Voir le cours sur le FRET.

Illustration du FRET par chevauchement des spectres [émission de fluorescence du donneur - excitation de fluorescence de l'accepteur]

Aller à l'application AAT Bioquest :

• Pour ajouter un fluorophore :menu "Add", choisir "Fluorophore".
• Pour modifier les axes et l'épaisseur des traits : menu "Display" => options "set axis" & "set line width".

• Représenter le chevauchement des spectres [émission DAPI - excitation FITC] entre 350 nm et 600 nm.
• Idem pour le couple [émission DAPI - excitation GFP].

Figure ci-dessous : la zone de chevauchement (en orange hachuré) des spectres d'émission du DAPI (en violet) et d'excitation du FITC (en vert) illustrent le transfert d'énergie (FRET) important entre ces fluorophores.

Figure adaptée de : AAT Bioquest

Autres applications en ligne de visualisation de spectres d'émission et d'excitation de fluorophores

a. Aller à l'application Thermofisher Viewer :

• Pour ajouter un fluorophore, utiliser le cadre "+ Add new fluorophore" en bas à droite.
• Représenter le chevauchement des spectres [émission DAPI - excitation FITC] entre 350 nm et 600 nm.
• Idem pour le couple [émission DAPI - excitation GFP].

b. Aller au site Chroma :

• Avec l'application "Spectra viewer", sélectionner les fluorochromes DAPI et FITC et représenter le chevauchement des spectres [émission DAPI - excitation FITC] entre 350 nm et 600 nm (bouton bleu "update").
• Idem pour le couple [émission DAPI - excitation GFP].

Si l'application "Spectra viewer" n'est pas fonctionnelle :

• Accéder aux spectres d'excitation/d'émission du DAPI.
• Accéder aux spectres d'excitation/d'émission du FITC.
• Sinon, passer par "Browse By Fluorochrome" si cette option s'affiche en haut à droite de la page.