1. Introduction : les domaines en omique

2. Notion de cellules individualisées ("Single-Cell")

a. Généralité
b. Evolution de l'approche cellules individualisées
c. Exemples d'apports du séquençage du transcriptome de cellules individualisées ("Single-Cell RNAseq" - scRNAseq)
d. Marché financier généré par le "Single-Cell"

3. La microfluidique appliquée au "Single-Cell"

a. Présentation générale
b. Illustration d'un systéme micro-fluidique
c. Protocole général des méthodes à base de goutellettes

4. L'identifiant moléculaire unique (UMI)

5. La transcriptomique de cellules individualisées (scRNAseq)

a. Démarche générale d'une expérience scRNAseq

b. Réduction de la dimension des données scRNAseq
c. Evolution des méthodes de scRNAseq
d. La transcriptomique résolue spatialement ("spatial transcriptomics")

6. Méthodes omiques multimodales pour l'analyse de cellules individualisées ("Single-Cell multi-omics methods")

7. La prédiction des trajectoires de cellules individualisées

a. L'inférence des trajectoires
b. Le pseudo-temps ("pseudotime")
c. Apports de l'analyse des trajectoires et du pseudo-temps
d. Complément sur les trajectoires
e. Algorithmes de prédiction des trajectoires
f. Illustration des trajectoires

8. Comparaison des puces à ADN et de la technique RNA-seq

9. Liens Internet et références bibliographiques

1. Introduction : les domaines en omiques

Il existe de nombreux sous-domaines scientifiques biologiques dont le nom a été créé avec le suffixe "omique". En voici les principaux exemples : génomique - métagénomique - épigénomique - transcriptomique - épitranscriptomique - translatomique - protéomique - métabolomique - interactomique - connectomique - fluxomique - integromique - glycomique - glycoprotéomique - lipidomique - pharmacogénomique, ...

• Les anglo-saxons emploient le suffixe "omics".
• Voir : "List of omics topics in biology".
• La protéogénomique est l'analyse intégrative des données de génomique, de transcriptomique, de protéomique et de modifications post-traductionnelles.

Les figures ci-dessous montrent la répartition des publications (articles) scientifiques dans la base de données bibliographique PubMed qui mentionnent un ou plusieurs domaine(s) en "omique" :

Source : Noor et al. (2019)

• (a) Nombre total d'articles par année depuis 2000 dans 4 domaines en "omique".
• (b) Diagramme de Venn montrant le chevauchement des articles qui mentionnent un ou plusieurs domaine(s) en "omique". Les "multi-omiques" les plus courants sont pour l'instant [génomique + protéomique] et [génomique + transcriptomique] qui représentent plus de 10% des articles.
• (c) Pourcentage de publications "multiomiques" mentionnant au moins deux des trois domaines transcriptomique, protéomique et métabolomique (la génomique est omise).

Ces domaines sont désormais en "interaction", assistée par la progession en imagerie de fluorescence :

• L'ère de l'analyse multi-omiques spatiale est commencée.
• Elle se transforme progressivement en une approche globale intégrée gérée par une méthode issue de l'intelligence artificielle.

2. Notion de cellules individualisées ("Single-Cell").

a. Généralité

Il y a environ 30.000 milliards (3 10¹³) de cellules dans le corps humain adulte. Les cellules humaines ont été classées en environ 300 types en fonction de leur emplacement et de leur fonction.

Avant l'avènement des techniques physico-chimiques permettant de désolidariser les cellules d'un tissu puis de les séparer tout en préservant totalement leur intégrité structurale et leur contenu, les expériences ont, pendant des décennies (et encore maintenant), analysé des mélanges non contrôlés de cellules de différents types, à différents stades de leur existence et en nombre respectif inconnu (souvent décrit en anglais par l'expression "bulk cells").

Les résultats obtenus correspondent donc à une "moyenne" de l'ensemble du contenu et de la proportion relative de ces jeux de cellules d'un tissu donné, sans distinction aucune.

• Il serait inapproprié de considérer, rétrospectivement, que l'ensemble des résultats obtenus avec des "mélanges de cellules" sont entachés d'erreur.
• Il n'en demeure pas moins qu'individualiser les cellules afin de les étudier 1 à 1 et comparer toutes les cellules idividualiseés est un pas conceptuel et scientifique considérable.
• Décrire les interactions et les variations inter-individuelles est essentiel pour comprendre l'état cellulaire réel.

Voir un remarquable glossaire à la fin de l'article de Heumos et al. (2023).

b. Evolution de l'approche cellules individualisées ("Single-Cell")

Les méthodes évoluent très rapidement et le nombre de cellules étudiées ne cessent de croître :

• La première expérience de séquençage d'ARN de cellules individualisées a été publiée en 2009 (Tang et al., 2009) : les auteurs ont analysé le profil de 8 cellules.
• En 2016, la société 10XGenomics a publié un ensemble de données de plus de 1,3 million de cellules individualisées.
• Certaines méthodes de calculs informatiques (variante du clustering k-means) permettent l'intégration d'ensembles de données de 500.000 cellules individualisées avec un ordinateur personnel.

Source : Jovic et al. (2022)

La figure ci-dessous montre Le nombre d'articles dans la base de données PubMed mentionnant "Single-Cell" dans leur titre depuis la première publication de la méthode en 2009 (Tang et al.).

Source : Tarhan et al. (2023)

Les profils transcriptomiques de plus de 100 millions de cellules individualisées ont été analysés avec le séquençage d'ARN "Single-cell RNA-seq" ou "Single-nucleus RNA-seq" (noyau individualisés) dans de multiples conditions biologiques.

De nouvelles plateforme WEB proposent des analyses complètes dans divers domaines omiques (exemple : CZ CELLxGENE).

c. Exemples d'apports du séquençage du transcriptome de cellules individualisées ("Single-Cell RNAseq" - scRNAseq)

On appelle "bulk cells" le mélange hétérogène de populations de cellules différentes.

• Mesure précise du taux de transcription de chaque cellule.
• Analyse du rôle des différents types d'ARN selon le type de cellules.
• Découverte de sous-types cellulaires (transcriptomes différents avec un génotype identique).
• Décryptage des caractéristiques de chaque type de cellules : nombre, forme, composition, développement (états cellulaires et cycle cellulaire, trajectoire, ...).
• Détection et caractérisation de cellules rares et de cellules pathologiques.
• Analyse de systèmes biologiques complexes tel que le système immunitaire.
• Compréhension du rôle de chaque type de cellules dans les mécanismes pathologiques.

Source : Yoon & Lee (2022)

d. Marché financier généré par le "Single-Cell"

La taille du marché mondial de l'analyse de cellules individualisées représentait 3 milliards de dollars en 2022 et devrait atteindre environ 14,61 milliards de dollars d'ici 2032 (croissance de #17 dans la période 2023 - 2032).

Source : Precedence Research

3. La microfluidique appliquée au "Single-Cell"

a. Présentation générale

Les avancées technologiques en microfluidique ("lab-on-a-chip") ont été déterminantes pour développer l'analyse de cellules individualisées.

La microfluidique permet de manipuler des volumes extrêmement faibles (10^-9 L à 10^-18 L) de fluides dans des canaux, des plaques multi-puits ou des chambres de mélange à l'échelle micrométrique.

Source : Deng et al. (2023)

Les dispositifs microfluidiques piègent les cellules à l'intérieur de gouttelettes ("droplets") : elles sont ainsi compartimentées dans des chambres où ont lieu les réactions sur chaque cellule individualisée.

La microfluidique à base de gouttelettes ("droplet-based microfluidics") permet :

• L'écoulement de très faibles volumes de fluides non miscibles.
• Un régime d'écoulement laminaire caractérisé par un faible nombre de Reynolds (Re<1).
• Ecoulement laminaire : si la vitesse d'écoulement est faible, la viscosité du fluide est prépondérante par rapport à la vitesse. L'écoulement s'effectue de manière linéaire, sans tourbillon. Les molécules dans le fluide conservent leur vitesse respective.
• Taille des gouttes (phase aqueuse dans l'huile) : 10 à 100 μm.

Les phases non miscibles de ces systèmes sont respectivement :

• La phase continue (le milieu dans lequel s'écoulent les gouttelettes).
• La phase dispersée (celle des gouttelettes).

Source : Klein et al. (2015)

A droite : phase d'encapsulation; à gauche : phase de collecte.
Flèche rouge : cellules; flèche bleue : hydrogel; flèche noire : sens du flux.
Voir une vidéo du mélange et de l'écoulement (partie "Supplementary Material" de l'article).

b. Illustration d'un systéme micro-fluidique

Figure ci-dessous : schéma d'un mélangeur microfluidique à base de gouttelettes ("droplet-based microfluidic mixer").

• Les "piliers" espacés dans les entrées (zone agrandie) fonctionnent comme des filtres qui empêchent les particules de pénétrer dans les canaux et de bloquer l'appareil.
• La région agrandie représente l'introduction de l'échantillon, la formation des gouttelettes, le mélange (une gouttelette est représentée), la région de décélération et le canal d'observation des gouttelettes.

Source : Klein et al. (2015)

Figure ci-dessous : mélangeur microfluidique en fonctionnement.

• Une gouttelette colorée à différents moments indique les changements de vitesse des gouttelettes dans différentes régions de l'appareil (accélération puis décélération).
• La barre d'échelle correspond à 100 µm.

Source : Klein et al. (2015)

c. Protocole général des méthodes à base de goutellettes

Les goutelletes ("droplets")

Les dispositifs microfluidiques piègent chaque cellule individualisée à l'intérieur d'une gouttelette d'un volume de l'ordre du nanolitre (10^-9 L).

Chaque cellule individualisée est donc ainsi compartimentée dans une chambre où a lieu l'ensemble des réactions de lyse cellulaire, d'étiquetage, d'amplification et autres.

Les protocoles les plus utilisés (exemples : "inDrop", "Drop-seq" et "10xGenomics Chromium") génèrent ces gouttelettes plusieurs milliers de fois par seconde (processus massivement parallèle) pour un coût relativement faible.

Les microbilles ("microbeads")

Par ailleurs, un hydrogel contient une microbille ("microbead") sur laquelle est greffée une amorce spécifique elle-même constituée :

• (i) d'une séquence pour l'amplification PCR.
• (ii) d'une séquence code-barre pour reconnaitre le type cellulaire.
• (iii) d'une séquence appelée identifiant moléculaire unique ("Unique Molecular Identifier" - UMI) de 4 à 8 pb :
  • L'UMI marque de manière unique chaque molécule d'ADN ou d'ADNc.
  • Si l'UMI est constituée de 8 pb, il existe 4⁸= 65536 possibilités de code-barres par microbille.
• (iv) d'une séquence queue poly-T complémentaire de la queue poly-adénylée des ARN messagers.

Enfin, chaque cellule individualisée est encapsulée avec une microbille dans une gouttelette.

Lyse des cellules et libération du transcriptome de chaque cellule individualisée

• Lors de la lyse cellulaire qui s'en suit, les ARN messagers de chaque cellule individualisée qui sont libérés sont immédiatement capturés par les oligonucléotides [amplification / code-barre / UMI / queue poly-T] fixés sur chaque microbille dans la goutelette.
• Les gouttelettes sont collectées et disloquées : le transcriptome (l'ensemble des transcrits) d'une cellule individualisée attaché aux microparticules ("Single-cell Transcriptomes Attached to MicroParticles" - STAMP) est ainsi libéré.

Source : Klein et al. (2016)

Transcription inverse, amplification, construction de bibliothèques

• L'étape suivante est une transcription inverse (synthèse de cDNA) couplée à une amplification PCR des transcrits.
• La "tagmentation" (marquage par une étiquette ou "tag") a lieu lorsque les transcrits sont coupées de manière aléatoire et que des adaptateurs de séquençage y sont attachés.
• On obtient ainsi les bibliothèques qui permettent de séquencer les transcriptomes (STAMP) individualisés de [milliers - millions] de cellules en une fois.

Figure adaptée de Elveflow

Enfin, le couple [code-barre / UMI] de chaque transcrit (ARNm) de chaque transcriptome (STAMP) permet d'associer chaque transcrit (ARNm) à sa cellule d'origine et d'en effectuer le comptage.

Source : Macosko et al. (2016)

Deux types de codes-barres (courtes étiquettes nucléotidiques d'environ 16 pb)

Code-barres de cellules ("Cell Barcode") : les séquences ayant le même code-barres de cellules indiquent qu'elles proviennent de la même cellule, ce qui permet de les regrouper (comptage).

Code-barres de caractéristiques ("Feature Barcode") : il est utilisé comme étiquette supplémentaire quand une protéine particulière est présente à la surface de la cellule. En effet, ce type de code-barres est concaténé à un anticorps dirigé contre cette protéine. Il peut être ensuite attribué à un code-barres de cellules.

Dans la technologie appelée "Cell Ranger's" de 10xGenomics, chaque construction d'ADNc pleine longueur est flanquée d'un oligonucléotides de commutation de modèle ("Template Switch Oligo" - TSO) de 30 pb (séquence AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG) à l'extrémité 5' et d'une séquence poly-A à l'extrémité 3'.

4. L'identifiant moléculaire unique (UMI)

Un identifiant moléculaire unique ("Unique Molecular Identifier"  - UMI) est est une courte séquence nucléotidique qui marque de manière unique chaque molécule d'ADN ou d'ADNc d'une bibliothèque.

Le séquençage RNA-Seq quantifie précisément l'abondance de chaque transcrit (ARN) d'un échantillon.

• Lors de la préparation de la bibliothèque, l'étape de PCR amplifie les transcrits pour augmenter leur abondance respective.
• Cette amplification se traduit par de multiples copies de chaque acide nucléique d'origine que l'on ne peut pas distinguer les unes des autres : il est donc extrêmement difficile de déterminer le nombre initial de molécules dans l'échantillon de départ.
• L'utilisation d'UMI permet ainsi de quantifier ces molécules d'origine.

Chaque acide nucléique de l'échantillon de départ (avant amplification) est donc étiqueté avec ce type de "code-barre moléculaire" unique :

• Le logiciel bioinformatique corrige ainsi davantage les erreurs lors de l'amplification PCR et augmente la précision du séquençage (détection des séquences doublons).
• De plus, les allèles variants dans l'échantillon de départ (vrais variants) sont également distingués des erreurs introduites lors de la préparation de la bibliothèque, de l'enrichissement de la cible ou du séquençage.
• Les UMI sont très utiles pour les expériences qui utilisent des quantités initiales très faibles comme l'analyse du transriptome de cellules individualisées ("Single-Cell RNA-Seq" - scRNAseq).

5. La transcriptomique de cellules individualisées (scRNAseq)

Cette méthode permet d'obtenir les profils des transcrits de cellules individuelles et elle est considérée comme la référence pour définir les états cellulaires et les phénotypes.

Il n'est pas toujours possible d'obtenir des informations complètes sur chaque type d'ARN transcrit dans chaque type de cellule en raison de la très faible quantité de certains ARN. Dans ce cas, les modèles de transcription des gènes peuvent être décrits par des analyses de regroupement de gènes ("gene clustering analyses"). Cela permet de révéler l'existence de types de cellules rares au sein d'une population de cellules.

a. Démarche générale d'une expérience scRNAseq

• 1) Isolement / séparation de cellules individualisées.
• 2) Lyse des cellules dans des conditions qui préservent l'intégrité des ARN messagers (ARNm).
• 3) Capture / isolement des ARNm.
• 4) Transcription inverse des ARNm : synthèse de l'ADN complémentaire (ADNc).
• 5) Amplification et étiquetage des ADNc par des "codes-barres" (séquences nucléotidiques) cellulaires et, selon le protocole, par des UMI (séquences nucléotidiques).
• 6) Préparation des bibliothèques d'ADNc.
• 7) Les bibliothèques sont regroupées (multiplexées - "multiplexed") pour le séquençage.

• 8) Analyse bioinformatique des séquences lues ("reads") :
  • Contrôle qualité des séquences (fichiers FASTA, FASTQ, BAM & SAM), correction des données brutes ("raw data processing").
  • Regroupement ("clustering") et classification en fonction des codes-barres (démultiplexage - "demultiplexing")
  • Alignement des séquences et de comparaison avec des génomes, annotation.
  • ...

Source : Luecken et al. (2019)

• 9) Analyse biostatistique des données :
  • Réduction de dimension des données (exemple : "t-distributed Stochastic Neighbour Embedding" - t-SNE).
  • Analyse de la dynamique de transcription des gènes : expression différentielle ("Volcano plot"), prédiction de trajectoires, ...
  • Les séquences obtenues avec des protocoles utilisant des UMI sont davantage démultiplexées. Une donnée quantitative supplémentaire est ainsi obtenue : les données de décompte ("count data") des molécules d'ARNm.
  • Réseaux de régulation de transcription des gènes, réseaux d'interactions, ...
  • Visualisation de ces différentes informations.
  • ...

L'analyse bioinformatique et l'analyse biostatistique utilisent des ensembles de scripts ("pipeline"), généralement écrits en Python ou dans le langage R (voir les projets CRAN et Bioconductor).

• Voir un manuel de réference : "Single-cell best practices".
• Voir l'ensemble des scripts Jupyter book (Python) liés à ce manuel.

Diagramme de type "Volcano plot"

Il représente la dispersion de valeurs qui traduit leur signification statistique (valeur P - "P value") en fonction du facteur de changement du processus étudié ("fold change").

Dans le cas de la transcription de gènes (ARN), ce type de représentation met en évidence les gènes dont le taux de transcription est :

• Soit sous-élevé (à gauche du graphique), soit sur-élevé (à droite du graphique) par rapport à une condition de référence.
• Soit faiblement significatif du point de vue statistique (en bas du graphique), soit fortement significatif (en haut du graphique).

b. Réduction de dimensionnalité des données scRNAseq

Le séquençage des ARN messagers de cellules individualisées ("Single cell mRNA sequencing" - scRNAseq) mesure simultanément les niveaux de transcription des gènes de milliers de cellules individuelles : les résultats permettent d'étudier le taux de transcription de chaque cellule d'un même type (voire de chaque cellule de types différents dans le cas d'un tissu) et, par extension, d'étudier différents processus cellulaires.

Ces ensembles de données transcriptomiques très complexes sont de 1 ou plusieurs ordre(s) de grandeur plus grand(s) que ceux obtenus par l'analyse RNAseq classique d'un mélange de cellules (cellules non individualisées - RNAseq).

• Bien que la résolution extrêmement fine des données scRNAseq soit d'une très grande richesse en terme d'informations biologiques, elles sont par ailleurs caractérisées par une rareté, un bruit de fond et des artefacts techniques bien plus élevés que pour les données RNAseq.
• Elles nécessitent donc un pré-traitement et une normalisation qui leur sont spécifiques: l'analyse scRNAseq inclut notamment une réduction dimensionnelle pour atténuer le bruit et faciliter le calcul.
  • Le choix de la méthode de réduction dimensionnelle influence les analyses, les résultats et les conclusions.
  • Les méthodes (complexes du point de vue mathématique) principalement employées sont l'analyse en composantes principales (ACP) et les cartes de diffusion.
  • Voir Ahlmann-Eltze & Huber (2023).
• Le traitement de telles quantités de données nécessitent des scripts informatiques spécifiques (scripts R ou Python, Bioconductor, recueil de scripts GitHub, ...).

La table de comptage ("count table") est une matrice de nombres (avec de nombreux zéro) :

• Les lignes sont associées aux identifiants des gènes et les colonnes sont associées aux codes-barres des cellule.
• C'est la structure de données d'entrée élémentaire dans l'analyse des données scRNAseq.

Techniques fréquemment utilisées pour l'analyse des grands jeux de données scRNAseq

• Les techniques de réduction de dimensionnalité t-SNE ("t-Distributed Stochastic Neighbour Embedding") et UMAP ("Uniform Manifold Approximation and Projection") sont adaptées à la visualisation d'ensembles de données de grande dimension.
• Voir de superbes illustrations interactives de l'UMAP.

c. Evolution des méthodes de scRNAseq

Il existe 2 catégories principales de méthodes pour l'obtention de données transcriptomiques de cellules individualisées :

• Les méthodes basées sur des plaques ("plate-based methods") offrent une résolution plus élevée pour chaque cellule individualisée. Elles permettent de générer des transcrits pleine longueur ("full-length transcripts") et de détecter des transcrits rares. Ces méthodes sont limitées par la taille des plaques et le nombre de cellules utilisables pour l'analyse.
• Les méthodes basées sur les gouttelettes ("droplet-based methods") offrent un très haut débit de cellules individualisées (des milliers de cellules analysées en parallèle). Ces méthodes ne peuvent analyser les transcrits qu'à partir de leur extrémité 5' ou de leur extrémité 3', ne permettant pas de détecter la transcription allèlique spécifique.

La figure ci-dessous décrit la chronologie du développement de ces méthodes.

• La partie supérieure du graphique montre les principales étapes marquant l'augmentation du débit de séquençage.
• La partie inférieure montre l'amélioration de la sensibilité.
• La première expérience de séquençage d'ARN de 8 cellules individualisées a été publiée en 2009 (Tang et al.).

Source : Pan et al. (2022)

Les réactions chimiques et les stratégies développées pour mettre au point les premières méthodes à faible débit ont permis le développement de celles à très haut débit. L'introduction des technologies de microfluidique a permis le changement d'échelle et le traitement massivement parallèle de cellules individualisées (méthodes à haut débit).

• STRT-Seq : Single-Cell Tagged Reverse Transcription sequencing
• Smart-Seq :
• CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by multiplexed linear amplification
• Fluidigm C1 system (96 cellules individualisées en 2012) : détection des sites d'initiation de la transcription et de l'activité des sites "enhancer" (activateur de la transcription) de cellules individualisées.
• MARS-Seq : Massively parallel RNA Single-Cell sequencing framework
• MATQ-Seq : Multiple Annealing and dC-Tailing-based Quantitative scRNA-seq
• 10xGenomics : basée sur des gouttelettes microfluidiques.
• sci-RNA-seq et SPLiT-seq : stratégie d'indexation combinatoire : au lieu d'un compartimentage physique de cellules individualisées, l'objectif de marquer plusieurs dizaines de milliers de transcriptomes unicellulaires sont marqués en même temps par des cycles de division ("to split") puis de mélange ("to pool").
• FACS : Fluorescence-Activated Cell Sorting

Des protocoles comme STRT-Seq et CEL-Seq ont introduit la stratégie des codes-barres ("barcode") spécifiques de chaque type de cellule :

• Tous les transcrits d'une seule cellule sont étiquetés avec le même code-barre, unique pour chaque cellule.
• Ce code-barre est une courte séquence oligonucléotidique identifiée lors du séquençage.
• Il permet d'associer chaque transcrit à la cellule dont il est issu et ainsi d'effectuer un traitement parallèle.

d. La transcriptomique résolue spatialement ("spatial transcriptomics")

C'est une méthode récente utilisée pour analyser les données de RNA-seq en 3 dimensions au sein d'une [superposition / juxtaposition] de cellules de divers types dans des coupes de tissus.

• Les coupes de tissu sont placées sur une lame de verre de microscope recouverte de plusieurs milliers de séquences ordonnées de "capture" des ARN messagers : chaque séquence est une amorce oligo(dT) à code-barre unique permettant la capture des ARN messagers dans l'espace.
• Les coupes de tissus sont ensuite colorées avec l'hématoxyline et l'éosine et imagées par microscopie à lumière transmise.
• Cette étape est suivie d'une perméabilisation douce, de la capture des ARN messagers par les sondes oligo(dT) et enfin d'un séquençage RNA-seq.
• L'analyse des données résultantes fournit un lien direct entre l'histologie et les données RNA-seq.

Source : Stahl et al. (2016)

La revue scientifique "Nature Methods" a couronné la méthode de transcriptomique résolue spatialement en 2020.

6. Méthodes omiques multimodales pour l'analyse de cellules individualisées ("Single-Cell multi-omics methods").

Les méthodes omiques développées jusqu'en 2010 (environ) ont permis d'analyser :

• Un type de données omiques à la fois : séquence d'ADN, séquences et nombre de transcrits, accessibilité et modification de la chromatine, abondance, types et localisation des protéines, ...
• D'un ensemble d'entités biologiques (tissus, cellules, génomes, ARN, ...) non individualisées.

Cette ségrégation résultait de contraintes méthodologiques et, bien que très riche en informations diverses, elle limitait la description des relations entre les macromolécules biologiques dans des cellules individualisées. Les avancées en biologie moléculaire, en microfluidique et en nanotechnologies ont donné naissance aux méthodes omiques multimodales unicellulaires ("Single-Cell multimodal omics methods").

Ces méthodes :

• Mesurent simultanément plusieurs types de données omiques dans une expérience.
• Ou intègrent différents types de données omiques à partir d'expériences multiples.
• Dans les deux cas, les données sont issues d'un très grand nombre de cellules individualisées. Actuellement, entre 100 cellules et 1 million de cellules environ, selon le type de données omiques donc la technologie employée.
• Dévoilent l'hétérogénéité intercellulaire de divers types de biomolécules.
• Mesurent simultanément deux ou plusieurs caractéristiques moléculaires de milliers de cellules individualisées.

Source : Stuart & Satija (2019)

Voir une chronologie des méthodes omiques spatiales basées sur les cellules individualisées.

7. Les trajectoires de cellules individualisées et le pseudo-temps

L'obtention d'un échantillon cellulaire à un moment donné de son existence inclue la coexistence d'un très grand nombre de types de cellules et de stades cellulaires d'un même type de cellule : cette grande diversité cellulaire résulte du caractère asynchrone de l'évolution des cellules et de l'ensemble des processus biologiques.

a. L'inférence des trajectoires

L'analyse bioinformatique de l'inférence des trajectoires permet de décrire la progression de chaque cellule individualisée de chaque type de cellules au cours des processus biologiques qui impliquent une évolution de ces cellules (différenciation, développement, processus pathologique, ...).

Les trajectoires mettent en évidence des points de ramifications où le devenir des cellules diverge : ces ramifications traduisent donc des décisions cruciales, à certains stades de ces processus, qui déterminent des destins cellulaires distincts.

b. Le pseudo-temps ("pseudotime")

En ordonnant les cellules en fonction de leur profil transcriptionnel (ARN), l'analyse des trajectoires attribue un pseudo-temps ("pseudo-time")" à chaque cellule individualisée qui reflète sa position le long de la trajectoire inférée.

En d'autres termes, le pseudo-temps positionne une cellule le long de la trajectoire de progression d'un processus biologique.

Par exemple :

• Le pseudo-temps d'une trajectoire de différenciation représente le degré de différenciation d'une cellule pluripotente vers un état terminal.
• Les cellules ayant des valeurs de pseudo-temps plus grandes sont plus différenciées.

Le pseudo-temps permet donc de classer les cellules les unes par rapport aux autres selon leur stade au cours d'un processus biologique considéré.

• Par exemple, les cellules souches hématopoïétiques de moelle osseuse sont caractérisées par un pseudo-temps faible et les cellules érythroïdes par un pseudo-temps élevé.
• Dans le cas de données de séquençage d'ARN de cellules individualisées (scRNAseq), les valeurs du pseudo-temps sont basées sur le profil transcriptomique d'une cellule. De plus, la construction nécessite généralement la spécification d'une cellule "racine" dans laquelle le processus étudié commence.

Voir un recueil GitHub de dizaines d'algorithmes d'estimation du pseudo-temps de cellules individualisées.

c. Apports de l'analyse des trajectoires et du pseudo-temps

Source : "Trajectory Inference and Pseudotime"

• Identifier des gènes dont le taux de transcription varie au cours de la trajectoire.
• Comparer les modèles de transcription des gènes selon les branches.
• Identifier les points de ramification entre trajectoires.

d. Complément sur les trajectoires

Les données en omique issues de cellules individualisées permettent l'étude de processus cellulaires dynamiques tels que le cycle cellulaire, la différenciation cellulaire et l'activation cellulaire.

De tels processus dynamiques peuvent être modélisés par des moyens informatiques avec des méthodes de prédiction de trajectoire (ou analyse pseudo-temporelle) qui ordonnent les cellules le long d'une trajectoire en fonction des similitudes de leurs modèles d'expression.

• Les trajectoires résultantes sont le plus souvent linéaires, bifurquantes ou arborescentes.
• Des méthodes récentes permettent de décrire des trajectoires plus complexes comme les graphes cycliques ou déconnectés.

La figure ci-dessous illustre quelques méthodes appliquées à un ensemble de données contenant (a) une trajectoire linéaire de cellules dendritiques de différenciation et (b) une trajectoire bifurquante de fibroblastes reprogrammés.

Source : Saelens et al. (2019)

e. Algorithmes de prédiction des trajectoires

Souvent, les trajectoires des cellules individualisées sont constituées d'embranchements. Ces branches de trajectoires traduisent le devenir des cellules au cours de leur développement : une lignée de cellules en développement suit une voie, tandis qu'une autre emprunte une autre voie.

Une catégorie d'algorithmes de prédiction de trajectoire est basée sur l'algorithme appelé "arbre couvrant de poids minimal" ("Minimum Spanning Tree" - MST) qui a pour but de déduire la trajectoire de développement de cellules individualisées.

• Le logiciel Monocle est une méthode de prédiction pseudo-temporelle qui utilise l'algorithme MST sur des cellules individualisées pour trouver le chemin le plus long et déterminer le pseudo-temps de chaque cellule.
• Le logiciel Monocle2 apprend la trajectoire des cellules avec l'algorithme MST et met à jour les positions des cellules en les déplaçant vers le sommet le plus proche de l'arbre MST.

Source : Monocle

Une autre catégorie d'algorithmes de prédiction de trajectoire est basée sur des graphes.

• La métrique appelée "Diffusion PseudoTime" (DPT) utilise un algorithme pondéré du k-voisin le plus proche ("weighted k-nearest-neighbor" - KNN) pour construire la trajectoire des cellules individualisées.
• Puis un algorithme calcule le pseudo-temps de diffusion des cellules dans un espace de diffusion (le résultat est un graphe symétrisé de type KNN).

Le logiciel Destiny utilise DPT.

Enfin il existe une catégorie d'algorithmes de prédiction de trajectoire basés sur la vitesse de l'ARN :

• Cette notion traduit la corrèlation entre l'abondance des ARN messagers en cours de biosynthèse et non épissés avec celle des ARN messagers matures épissés à l'aide d'un modèle cinétique simple du 1er ordre.
• La progression d'un état d'une cellule à un moment donné vers un état de cette même cellule à un moment ultérieur est estimée en utilisant cette vitesse.

Les logiciels VeTra et Cytopath suivent cette démarche.

f. Illustration des trajectoires

Figure ci-dessous : UMAP ("Uniform Manifold Approximation and Projection") basé sur l'analyse scRNA-Seq de 38091 cellules à partir de rétines natives de souris et d'organoïdes rétiniens dérivés de cellules souches pluripotentes induites à 4 stades de développement appariés qui couvrent l'émergence des principaux types de cellules rétiniennes.

Source : Georges et al. (2023)
Voir un film de ces trajectoires en 3D.

Les groupes ("clusters") ont été fusionnés en 13 principaux types de cellules rétiniennes (exemples : NE = neuroépithélium ; RPE = épithélium pigmenté ; C = cônes, ...).

Les gènes responsables des rétinopathies sont sur-représentés dans la catégorie de ceux qui spécifient le type cellulaire.

• Les trajectoires (flèches noires) résument l'ensemble des informations combinées d'échantillonnage temporel, de variétés UMAP3D, d'analyse de pseudo-temps et d'analyse des vitesses d'ARN.
• Le point gris au centre de NE est la racine des trajectoires.

8. Comparaison des puces à ADN et de la technique RNA-seq

a. Les puces à ADN et la technique RNA-seq ont toutes deux une haute reproductibilité de résultats avec des réplicats biologiques.

b. Les puces à ADN permettent difficilement de distinguer le cas "pas de transcription" du cas "très faible transcription".

c. En raison de la différence de transcription des gènes et/ou du nombre de gènes codant un même type d'ARN messager, il n'existe dans une cellule que quelques copies de certains ARN messagers et des dizaines de milliers de copies d'autres ARN messagers :

• La sensibilité de détection des ARN messagers rares est donc un paramètre capital.
• La sensibilité de détection de la technique RNA-seq dépend de la profondeur du séquençage et celle des puces à ADN est quasiment constante. Celà signifie qu'en théorie, si on atteind une profondeur de séquençage suffisante, la technique RNA-seq permet de déterminer le nombre réel de toutes les molécules d'ARN dans un échantillon.

d. De multiples transcrits sont générés à partir de certains gènes par épissage alternatif. L'un des avantages de la technique RNA-Seq est sa capacité à détecter ces isoformes différentiellement transcrites :

• En effet, sur une puce à ADN, une sonde courte donnée cible soit un exon constitutif (présent dans tous les transcrits issus de l'épissage alternatif), soit un exon spécifique de l'un des transcrits. Dans le second cas, ce transcrit est détecté mais les autres transcrits issus du même gène sont ignorés.
• En conséquence, les ensembles de sondes de puces à ADN ne peuvent pas représenter tous les transcrits de tous les gènes.

e. Les puces à ADN sont sujettes à une saturation d'hybridation en ce qui concerne les transcrits très abondants. Elles ne peuvent pas fournir des mesures quantitatives fiables des changements subtils de la transcription de gènes abondants.

f. La technique RNA-Seq permet d'identifier des variants d'un seul nucléotide ("single nucleotide polymorphism" - SNP). La technique RNA-Seq présente deux avantages dans la détection de variants génétiques :

• Aucune connaissance préalable concernant des variants potentiels n'est requise.
• La détection est faite sur l'ensemble du génome même pour les rares SNP.

g. La technique RNA-Seq permet :

• de détecter la transcription spécifique d'un allèle
• d'identifier les différences ARN-ADN
• d'étudier l'édition des ARN (exemples : A => I et C => U)
• d'identifier significativement plus de gènes

La technique RNA-seq nécessite des moyens bioinformatiques importants pour l'analyse des données.

Par ailleurs, l'un des atouts (qui ne peut que s'estomper avec le temps) des puces à ADN est l'acquis des dizaines de milliers d'expériences qui ont été menées avec cette technique et les différentes annotations des transcriptomes issues de toutes ces expériences.

L'un des atouts de la technique RNA-seq (ou d'une autre technologie à venir) est l'évolution très rapide des technologies de séquençage à très haut débit : le développement des méthodes avec multiplexage par répartition codes barres, des lectures ("reads") plus longues et un plus grand nombre de lectures appariées ("paired end reads").

Pour l'instant les puces à ADN et la technique RNA-seq restent donc complémentaires et peuvent même être combinées avec des résultats très importants.