1. Présentation générale

2. Classification des différents systèmes CRISPR-Cas

3. Les motifs PAM ("Protospacer Adjacent Motif") de l'ADN invasif

4. Le complexe [Cas1 - Cas2] : acquisition de la séquence espaceur

5. L'endonucléase Cas9

6. Structure et mécanisme catalytique de Cas9

7. Edition des gènes avec les systèmes CRISPR-Cas9 de type II

8. Compléments sur la technique CRISPR-Cas

a. Les systèmes nucléases ZNF et TALEN

b. Exemples de développements et d'applications de diverses techniques CRISPR-Cas

c. Les questions éthiques que soulève la technique CRISPR-Cas

d. Bataille juridique concernant la paternité de la technique CRISPR-Cas

9. Quelques logiciels et sites WEB dédiés à CRISPR-Cas

10. Liens Internet et références bibliographiques

1. Présentation générale

Article de Ishino et al. en 1987 : mise en évidence d'une région de 5 répétitions partiellement palindromiques dans le génome d'Escherichia Coli à l'extrémité 3' du gène codant l'alcaline phosphatase.

Extrait de la fin de l'article de Ishino et al. (1987) : "An unusual structure was found in the 3'-end [...] Five highly homologous sequences of 29 nucleotides were arranged as direct repeats with 32 nucleotides as spacing. [...] A dyad symmetry with 14 nucleotide pairs was also found in the middle of these sequences [...] the biological significance of these sequences is not known."

Les terminologies ont beaucoup évolué (1987 => 2002) en fonction de la compréhension du processus.

• CRISPR ("Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats") :
  1. regroupement de courtes (21 à 48 paires de bases - les valeurs changent légèrement selon les sources) répétitions (jusqu'à 250 fois) de séquences d'ADN hautement conservées et (partiellement) palindromiques. Les répétitions ont en général une symétrie interne partielle, ce qui entraîne la formation de structure secondaire en épingle à cheveux.
  2. des séquences variables appelées espaceurs de longueur constante (20 à 58 paires de bases - les valeurs changent légèrement selon les sources) sont intercalées entre les séquences répétées.
  3. L'ensemble des répétitions - espaceurs CRISPR est appelé matrice CRISPR ("CRISPR array" ou "CRISPR locus").
• Cas ("CRISPR-associated") : gènes codant les endonucléases associées à CRISPR

CRISPR-Cas est le premier (et jusqu'à présent le seul) système de l'immunité adaptative découvert chez les archées et les bactéries : elles acquièrent ainsi une résistance à un ADN invasif.

Comme d'autres systèmes de défense, un système CRISPR-Cas est basé sur un mécanisme sophistiqué de discrimination [soi / non-soi].

Voir l'interférence ARN par comparaison.

Phase d'acquisition (aussi appelée d'adaptation) : un système CRISPR-Cas conserve de courtes séquences d'ADN invasif (les séquences espaceurs - "spacers") comme éléments de mémoire des génomes des virus et des plasmides rencontrés.

Phase de transcription - maturation : la matrice CRISPR (ensemble des séquences répétées - "repeats" - et des séquences espaceurs) est transcrite en un long transcrit primaire appelé pre-crRNA.

Celui-ci est maturé en un ensemble de courts fragments d'ARN appelés crRNAs ("CRISPR RNAs") : chacun d'entre eux contient une séquence unique complémentaire d'un fragment d'ADN invasif.

Phase d'interférence : Les crRNAs sont utilisés comme ARN guide des protéines Cas pour cibler et hydrolyser l'ADN apparenté de virus ou de plasmides invasifs lors de nouvelles infections.

Source : The Doudna Lab

La séquence de tête ("leader sequence") est une longue séquence riche en AT positionnée immédiatement en amont de la matrice CRISPR. Elle contient généralement à la fois le promoteur qui commande la transcription des crRNAs et la séquence de reconnaissance pour l'insertion de la séquence espaceur.

Une matrice CRISPR :

• Courtes séquences répétées ("crRNA") qui constituent un élément capital de la régulation des systèmes CRISPR-Cas, car elles servent de point de fixation des protéines Cas dans les trois phases du mécanisme.
• Séquences espaceurs issues de l'ADN invasif (en couleur / figure ci-dessous)

Source : NEB	Source : Hille et al. (2018)

pre-crRNA : long transcrit primaire issu de la matrice CRISPR

crRNAs : courtes séquences d'ARN issues de la maturation des séquences répétées du pre-crRNA

tracrRNA ("trans-acting small RNA") : petit ARN qui s'apparie avec chaque répétition du pre-crRNA pour former un ARN double brin [tracrRNA:crRNA]

séquence espaceur (porté par le crRNA mature) : séquence complémentaire de la séquence cible de l'ADN invasif (appelée proto-espaceur - "protospacer") afin qu'il y ait hybridation

PAM ("Protospacer Adjacent Motif) : séquence de l'ADN invasif qui suit immédiatement la séquence cible proto-espaceur

Séquence de la matrice CRISPR-Cpf1 de type V de F. novicida U112 depuis le début de la séquence de tête (minuscule - gris) jusqu'à la dernière séquence répétée.

Source : Fonfara et al. (2016) Majuscules - noir : séquences répétées; minuscules - vert : séquences espaceurs

Les séquences encadrées correspondent aux crRNA matures : ils sont composés d'une partie d'une séquence répétée en 5' et d'une partie d'une séquence espaceur en 3'.

2. Classification des différents systèmes CRISPR-Cas

On distingue :

• La classe I (types I, III et IV) : systèmes CRISPR qui utilisent un module effecteur crRNA multimérique.
• La classe II (types II, V et VI) : systèmes CRISPR qui utilisent un module effecteur crRNA monomérique.
• En 2020, on dénombrait 2 classes, 6 types et 33 sous-types de systèmes CRISPR-Cas.

Source : Makarova et al. (2020)

Il existe 6 types de systèmes CRISPR-Cas de l'immunité adaptative qui diffèrent par :

• les répertoires de gènes associés aux CRISPR ("repertoires of cas genes")
• l'organisation des operons cas
• la structure des répétitions au sein des matrices CRISPR

Source : Jiang & Marraffini (2015)

Les systèmes CRISPR-Cas de types I utilisent des complexes multiprotéiques pour le ciblage guidé par le crRNA.

• endoribonucléases de la famille Cas6 : clivage du pre-crRNA et biogenèse des crRNA des systèmes de types I-A, I-B, I-D, I-E et I-F
• endoribonucléase Cas5d : clivage du pre-crRNA et biogenèse des crRNA des systèmes de type I-C
• Chez Escherichia coli, les crRNAs sont incorporés dans un complexe multimérique appelée Cascade ("CRISPR-associated complex for antiviral defense" - complexe associé à CRISPR pour la défense antivirale), système CRISPR-Cas de type I-E nécessaire pour la protection contre les bactériophages.

Les systèmes CRISPR-Cas de types II sont plus simples : un petit ARN agissant en trans appelé tracrRNA ("trans-acting small RNA") s'apparie avec chaque répétition du pre-crRNA pour former un ARN double brin [tracrRNA:crRNA] clivé par la RNase III en présence de l'endonucléase Cas9.

Ils générent des cassures double brin dans l'ADN invasif.

Les systèmes de types III sont plus complexes. Ces loci contiennent des gènes codant des protéines Cas10 et des modules Csm (pour le type III-A ) ou Cmr (pour le type III-B) qui forment ensemble les complexes de ciblage [Cas10-Csm] ou [Cas10-Cmr].

• Comme dans les systèmes de types I, le clivage du pre-crRNA est réalisée par Cas6. Cependant, l'endonucléase Cas6 ne fait pas partie du complexe Cas10.
• Les systèmes de types III ont deux caractéristiques : la transcription de la cible est nécessaire pour l'immunité et les deux cibles d'ADN sont clivées.

Composition des gènes cas des systèmes CRISPR-Cas de types I-A à I-F :

• Les matrices CRISPR sont constituées d'une série de répétitions (losanges noirs) entrecoupées par des séquences espaceurs du génome étranger (losanges colorés).
• Un opéron de gènes cas est situé à proximité immédiate de la matrice CRISPR.

Source des 3 figures : Charpentier et al. (2015)

Les endonucléases Cas impliquées dans la biogenèse des crRNA des systèmes de types III-A et III-B appartiennent à la famille Cas6.

Classe 2 : exemple du système CRISPR de type VI

Ce système englobe la protéine C2c2 - Cas13a (bactérie Leptotrichia shahii) :

• La protéine C2c2 (désormais appelée Cas13a) fait partie d'une famille d'enzymes qui possèdent 2 activités distinctes de reconnaissance et de clivage de l'ARN : la protéine C2c2 - Cas13a (une sous-unité) fonctionne donc comme une endonucléase d'ARN (activité RNase) guidée par un ARN.
• Les deux activités RNase de C2c2 - Cas13a permettent le chargement d'ARN guide qui permet à son tour une détection sensible de transcrits dans la cellule.
• East-Seletsky et al. (2016)
• SHERLOCK ("Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing") : plate-forme de détection qui utilise C2c2 - Cas13a et un ARN CRISPR court. Les seuils de détection deviennent étonnant : de l'ordre du femtoM (fM - 10^-15 M), voire attoM (aM - 10^-18 M).

Découverte de nouveaux systèmes CRISPR-Cas

La découverte de nouveaux systèmes CRISPR-Cas évolue très rapidement. Par exemple, l'étude de 155 millions de gènes codant des protéines (gènes issus d'un métagénome dérivé d'eaux souterraines, de drainages de mines, de sédiments, d'intestin de nourrisson et d'autres communautés microbiennes) a permis d'identifier :

Source : Burstein et al. (2017)

• Le premier système Cas9 issu du domaine des Archées (Candidatus Micrarchaeum acidiphilum ARMAN-1 et Candidatus Parvarchaeum acidiphilum ARMAN-4). Ce système de type II pourrait être issu de la fusion des systèmes de type II-B et II-C.
• Deux nouveaux systèmes CRISPR-Cas (appelés CRISPR-CasX et CRISPR-CasY) chez des bactéries non cultivées.

De nombreux outils bioinformatiques sont développés pour l'analyse des génomes afin de découvrir de nouveaux systèmes CRISPR-Cas et les classifier.

Source : CRISPRminer2

3. Les motifs PAM de l'ADN invasif

Les séquences répétées ("repeats") du locus CRISPR sont séparées par de courtes séquences d'ADN non répétitif - les séquences espaceurs ("spacers") - qui proviennent de l'ADN invasif d'un plasmide ou d'un virus lors de la phase d'adaptation.

Lors de l'interférence, la séquence nucléotidique espaceur (portée par le crRNA) doit être identique à une séquence du génome de ce plasmide ou de ce virus appelée proto-espaceur ("protospacer" - environ 20 nucléotides) afin que le complexe CRISPR-Cas bloque la réplication de l'ADN invasif.

Dans les systèmes CRISPR-Cas de types I, de types II et de types V, il existe une séquence possèdant un motif conservé qui suit immédiatement la séquence cible proto-espaceur.

Cette séquence de l'ADN invasif de 2 à 5 nucléotides est appelée motif adjacent au proto-espaceur ("Protospacer Adjacent Motif " - PAM).

Source : CRISPR Genome Engineering Resources

Le motif PAM est :

• une forme de tracrRNA
• nécessaire à l'acquisition des séquences espaceurs
• nécessaire à l'endonucléase Cas9 pour fixer l'ADN cible
• nécessaire au phènomène d'interférence

L'endonucléase Cas9 reconnaît le motif PAM au sein des séquences CRISPR répétées pour distinguer le soi du non-soi. La séparation ATP-indépendante des brins d'ADN nécessaire à la formation de l'hétéroduplexe [ARN guide - ADN cible] commence au niveau des motifs PAM.

La reconnaissance des motifs PAM est donc nécessaire pour l'activité catalytique. Les deux résidus arginine du motif de reconnaissance DR₁₃₃₃KR₁₃₃₅Y de l'endonucléase Cas9 sont critiques pour la fixation du motif PAM.

Le site de fixation de la séquence PAM a une structure désordonnée en absence d'ARN guide et des interactions avec le substrat.

Voir la structure tridimensionnelle 4UN3.

4. Le complexe [Cas1 - Cas2] : acquisition de la séquence espaceur

Le complexe intégrase [Cas1 - Cas2] est universellement conservé : les gènes codant les enzymes Cas1 et Cas2 (qui appartiennent en général au même opéron) sont les seuls présents dans les 45 familles recencées de systèmes CRISPR-Cas.

La phase d'acquisition de la séquence espaceur (courte séquence de l'ADN invasif) :

• Commence par la reconnaissance de l'ADN invasif par le complexe [Cas1 - Cas2].
• Elle est suivie par le clivage de la séquence proto-espaceur (30 à 40 paires de base selon le système CRISPR-Cas). Le complexe [Cas1 - Cas2] catalyse cette réaction via un mécanisme d'intégration nucléophile directe, semblable à celui des intégrases et des enzymes transposases des rétrovirus.
• La séquence espaceur est intégrée entre la séquence de tête ("leader sequence") et la première séquence répétée de la matrice CRISPR.
• L'intégration de la séquence espaceur est couplée à la duplication de la séquence répétée adjacente.

Ni Cas1, ni Cas2 ne semblent avoir un rôle dans la phase de transcription - maturation ou la phase d'interférence.

L'enzyme Cas1 seule hydrolyse (activité endonucléase) : l'ARN simple brin linéaire, l'ADN simple brin et l'ADN double brin court (34 nucléotides) et des séquences d'ADN ramifiées (jonctions de Holliday, fourches de réplication, ADN double brin avec un débord 5' sur l'un des brins, ...).

L'activité endonucléase de Cas2 n'intervient pas dans l'acquisition : la fonction principale de l'enzyme Cas2 est de former un échafaudage non catalytique au sein du complexe [Cas1-Cas2].

La structure du complexe [Cas1 - Cas2] de Escherichia coli lié à une séquence d'ADN proto-espaceur de 33 nucléotides a été déterminée : c'est un hexamère constitué de 4 enzymes Cas1 et 2 enzymes Cas2.

Source : Wang et al. (2015)

Le complexe [Cas1 - Cas2] modifie la conformation de la séquence d'ADN proto-espaceur : cette séquence est incurvée et enjambe le dimère central Cas2. Chacune de ses extrémités nucléophiles 3'-OH entre dans un canal qui mène aux sites actifs de Cas1.

Source : Amitai & Sorek (2016)

L'intégration nécessite un ADN cible super-enroulé et des extrémités 3'-OH sur l'ADN espaceur. L'intégration commence probablement par une attaque nucléophile de l'extrémité 3'-OH de la séquence proto-espaceur sur le brin négatif de la première séquence répétée.

Chez Escherichia coli, la reconnaissance de PAM met en jeu une poche formée dans un dimère Cas1.

Source : Amitai & Sorek (2016)

Cette poche reconnaît spécifiquement la séquence complémentaire de PAM (c'est-à-dire : 5'-CTT-3', puisque PAM de E. coli d'un système CRISPR-Cas de type I-E est 5'-AAG-3').

Cette poche positionne la séquence complémentaire de PAM dans une orientation correcte par rapport à l'histidine catalytique (His 208) du site actif de l'un des monomères Cas1. Cela conduit à l'hydrolyse de l'ADN simple brin :

• qui laisse 5 nucléotides d'ADN simple brin de la séquence complémentaire de PAM terminée par la cytosine C
• et forme la séquence proto-espaceur de 33 nucléotides (23 nucléotides d'ADN double brin + 5 nucléotides d'ADN simple brin en 5' + 5 nucléotides d'ADN simple brin en 3')
• la séquence de 23 nucléotides d'ADN double brin est encadrée par un résidu Tyr 22 de chacun des dimères Cas1.

Visualisation de Cas1 de Escherichia coli à une résolution de 1,95 Å

Code PDB : 3NKD

Autres systèmes CRISPR-Cas

Les systèmes CRISPR-Cas de types I et de types III adoptent une architecture en hélice qui s'enroulent autour du crRNA. Cette structure en hélice peut être le signe d'une évolution en réponse aux besoins topologiques pour fixer un hétéroduplexe [crRNA - ADN] plus long.

Les systèmes CRISPR-Cas de types I (7 sous-types) contiennent tous le gène cas3. L'enzyme Cas3 s'apparente aux hélicases.

L'agencement hélicoïdal ouvert du complexe Cascade (système de type I multi sous-unités) facilite probablement le recrutement de la nucléase Cas3 agissant en trans lors de l'hydrolyse de la séquence d'ADN cible.

Quand la matrice CRISPR contient déjà une séquence espaceur dirigée contre un phage ou un plasmide particulier, le mécanisme d'interférence Cascade et Cas3 des systèmes CRISPR-Cas de types I peut être aussi impliqué dans l'acquisition d'une séquence espaceur.

Les grandes sous-unités des systèmes de types III et des systèmes de types IV sont Cas10 et Csf1 (une enzyme de la famille Cas8), respectivement.

Source : Makarova et al. (2015)

Les 2 couleurs utilisées pour Cas4 (exonucléase de type RecB) et les 3 couleurs utilisées pour Cas9 traduisent le fait que ces enzymes participent à différents stades de la réponse CRISPR-Cas.

• CARF : "CRISPR-Associated Rossmann Fold"
• pre-crRNA : pre-CRISPR RNA

Par exemple, Cas9 est impliquée dans les 3 phases du mécanisme CRISPR-Cas (reconnaissance PAM et acquisition d'une séquence espaceur / phase de transcription et maturation, phase d'interférence).

Le domaine de fixation à l'ARN appelé RAMP ("Repeat-Associated Mysterious Protein") est présent dans les familles Cas5, Cas6, Cas7 et Cmr3.

5. L'endonucléase Cas9

L'endonucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpyCas9 ou Csn1 - 1368 acides aminés - Q99ZW2) est spécifique des systèmes de type II-A.

Elle contient deux domaine nucléase très conservés :

• le domaine RuvC (EC 3.1.22.4) : il hydrolyse des jonctions cruciformes formées par l'extrusion de séquences répétées inversées d'un plasmide super-enroulé. Ces jonctions sont analogues sur le plan structural aux jonctions Holliday, en introduisant des coupures dans les brins de même polarité. Les enzymes à domaine RuvC sont actives sous forme de dimère.

• le domaine HNH (EC 3.1.21.1) : le motif HNH est présent chez beaucoup d'enzymes qui constituent la superfamille HNH (les endonucléases, les colicines, les endonucléases de restriction, les transposases et les facteurs d'empaquetage de l'ADN). Le motif HNH est aussi le centre catalytique (noyau imidazole d'une histidine active) des endonucléases : il adopte une structure appelée ββα-Me (Me indique l'ion métallique qui s'y fixe).

Autour de ces domaines, l'endonucléase Cas9 contient des régions flanquantes dépourvues de similarité de séquence apparente avec des protéines de structures connues. L'activité endonucléase sur l'ADN cible double brin nécessite le cation Mg²⁺.

Source : Jinek et al. (2014)

• le domaine RuvC est constitué de trois segments discontinus (RuvC-I à RuvC-III : acides aminés 1 - 59, 718 - 769 et 909 - 1098) avec un lobe α-hélicoïdal inséré entre le premier et le deuxième segments.
• Arg : région riche en arginine
• le domaine HNH (acides aminés 775 - 908) est inséré entre le deuxième et le troisième segments
• Topo : domaine Topo-homologie
• le domaine C-terminal CTD (acides aminés 1099 - 1368) est impliqué dans la fixation du motif PAM

Dans les systèmes de type II, la maturation correcte du pre-crRNA nécessite le tracrRNA, la ribonucléase III et l'endonucléase Cas9.

Source : Millenium science

Le tracrRNA est partiellement complémentaire du crRNA et il sert de guide pour l'action de la ribonucléase III. La longueur des séquences tracrRNAs prédites est très variable (de 72 à 171 nucléotides).

Dans cette étape, l'endonucléase Cas9 stabilise l'interaction [tracrRNA:pre-crRNA]. Cas9 n'a pas de fonction catalytique dans la maturation du pre-crRNA.

L'endonucléase Cas9 reconnaît le motif PAM. Cette reconnaissance est une étape critique du ciblage de l'ADN par Cas9 : c'est une condition préalable à la séparation ATP-indépendante des brins et à la formation de l'hétéroduplexe [ARN guide - ADN cible] qui commencent au niveau du motif PAM.

Le complexe [Cas9:crRNA:tracrRNA] catalyse le clivage endo-nucléolytique de l'ADN double brin (linéaire ou circulaire) cible. Cas9 est inactive en absence des deux ARN guides.

• le domaine HNH de Cas9 clive le brin complémentaire de l'ADN cible
• le domaine RuvC clive le brin non complémentaire de l'ADN cible
• le brin cible non complémentaire du crRNA subit d'abord un clivage endo-nucléolytique puis un clivage exo-nucléolytique 3'-5 '

Le tracrRNA est également nécessaire au mécanisme d'interférence avec l'ADN invasif.

6. Structure et mécanisme catalytique de Cas9

a. Structure

La structure globale de Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) forme deux lobes : un lobe de reconnaissance (REC) et un lobe nucléase (NUC).

Structure du complexe [Cas9 / ARN guide / ADN cible] : ARN guide - rouge; ADN cible - orange; ADN non cible - fuchsia; trinucléotide PAM (5'-NGG-3') - jaune.
Source :3dciencia

Le lobe REC est composé des domaines REC1 et REC2 :

• REC1 adopte une structure α-hélicoïdale allongée qui contient 25 hélices α (α2-α5 et α12-α32) et 2 feuillets β (β6-β10 et β7-β9)
• REC2 adopte une structure en faisceau de six hélices (α6-α11)

Aucune similitude structurale du lobe REC avec d'autres protéines n'a pour l'instant été mise en évidence : il s'agirait donc d'un domaine fonctionnel dont le repliement est spécifique de l'enzyme Cas9.

Le lobe NUC est composé des domaines RuvC, HNH et CTD (domaine d'interaction avec PAM). Le lobe NUC forme une surface chargée positivement qui interagit avec l'extrémité 3' de l'ARN guide.

• Le domaine RuvC adopte un repliement RNase H et le domaine HNH adopte un repliement [ββα-Me].
• Le domaine d'interaction avec PAM (CTD) forme une structure allongée constituée de 7 hélices α (α46-α52) et de 3 feuillet β antiparallèles (β18-β20, β21-β23, β24-β27) à 2, 3 et 5 brins, respectivement. Le repliement adopté par le domaine d'interaction avec PAM semble également spécifique de l'enzyme Cas9.

b. Mécanisme catalytique

L'endonucléase Cas9 est dans une conformation auto-inhibée en absence d'acide nucléique ligand. Cas9 subit un réarrangement conformationnel très important lors de la fixation de l'ARN guide et ce réarrangement facilite la fixation de l'ADN cible.

L'ARN guide déroule l'hélice d'ADN cible : l'hétéroduplexe [ARN guide - ADN cible] est ainsi formé. Cet hétéroduplexe (chargé négativement) est fixé dans une gorge (chargée positivement) à l'interface des lobes REC et NUC. Cas9 plie l'hélice d'ADN de 30° : cela crée une boucle de type R ("R-loop") qui positionne chaque brin d'ADN pour l'hydrolyse par les deux domaines nucléase.

[Remarque : une boucle de type R est une structure d'acide nucléique à 3 brins, composée d'un hybride [ADN:ARN] et du brin d'ADN non matrice associé.]

Les deux lobes se referment pour former un canal central (d'une largeur d'environ 25 Å) : cette réorganisation semble positionner les deux centres catalytiques de l'enzyme sur des côtés opposés de ce canal et les deux brins d'ADN séparés sont fixés dans les deux sites actifs.

Les résidus Arg1333 et Arg1335 de SpCas9 reconnaissent les deux guanine du motif PAM NGG.

Source : Ishida et al. (2015)

Puis Ser1109 et Lys1107 interagissent avec un groupement phosphate adjacent au motif PAM, ce qui déclenche la fusion locale de l'ADN double brin, de sorte que l'ARN guide ("sgRNA" en vert - figure ci-contre) forme un appariement de type Watson-Crick avec le brin d'ADN complémentaire.

• Asp10 et His840 sont les principaux résidus catalytiques des domaines nucléase HNH et RuvC, respectivement.
• Asp1135 interagit avec la guanine en position 3 du motif PAM via une molécule d'eau. Le changement de cet aspartate en glutamate (D1135E) améliore la reconnaissance du motif PAM et la spécificité du ciblage.
• Lys1107 interagit avec la cytosine en position 2 du brin cible.

7. Edition des gènes avec les systèmes CRISPR-Cas9 de type II ("CRISPR-Cas9 genome editing")

Le système CRISPR-Cas9 nécessite un ARN spécifique pour recruter et diriger l'activité nucléase de Cas9 vers la séquence d'ADN cible du gène d'intérêt.

Cet ARN guide est :

• soit constitué du tracrRNA plus un crRNA, tous les deux synthétisés chimiquement (voir figure ci-dessus)
• soit un ARN guide unique ("single guide RNA" - sgRNA) qui correspond au tracrRNA et au crRNA en une seule construction (figure ci-dessous)

Source : Dharmacon

Démarche pour la conception d'un ARN guide unique

Une séquence d'ADN génomique de 20 nucléotides est choisie dans le gène que l'on souhaite cibler.

Par exemple, pour l'extinction d'un gène, on choisit une séquence cible située entièrement dans un exon constitutif du gène codant.

Cette séquence cible doit se situer immédiatement avant le motif PAM (NGG) : la séquence cible peut donc être choisie sur l'un ou l'autre des 2 brins d'ADN à condition qu'elle soit suivie du motif PAM.

L'un des avantages de la méthode dérivée de CRISPR est que le premier nucléotide de ce 20-mer peut être n'importe lequel des 4 nucléotides car le crRNA est obtenu par synthèse chimique.

Figure ci-dessous : exemple de séquence prédite d'ARN guide unique (sgRNA).

Source : Kim & Kim (2014)

8. Compléments sur la technique CRISPR-Cas

a. Les systèmes nucléases ZNF et TALEN

En raison de sa simplicité et des possibilités d'adaptation, la technique CRISPR est rapidement devenue la plus populaire pour l'ingénierie des génomes.

Elle a supplanté deux techniques préalables utilisant des nucléases - enzymes de restriction artificielles :

• les nucléases à doigts de zinc (ZFN - "Zinc Finger Nucleases")
• les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN - "Transcription-Activator-Like Effector Nuclease")

Une nucléase ZFN est constituée de deux domaines :

Source : Sigma

• Un domaine de fixation de l'ADN contenant 2 motifs à doigt de zinc. Chaque motif reconnait une séquence d'ADN hexamère unique de 6 paires de base. L'ensemble forme une protéine à doigt de zinc qui a une spécificité d'environ 24 paires de base.
• Un domaine endonucléase FokI qui hydrolyse l'ADN
• La fusion des deux types de domaines génère une nucléase hautement spécifique de séquence d'ADN cible.

Les nucléases TALEN sont synthétisées par fusion :

Source : Genome engineering

• D'un domaine de fixation à l'ADN, dérivé des protéines TALE sécrétées par Xanthomonas. Ce domaine contient de multiples séquences répétitives très conservées (33 - 35 acides aminés), chacune d'entre elles reconnaissant une paire de base spécifique.
• D'un domaine d'hydrolyse de l'ADN (endonucléase FokI).

En théorie, on peut donc créer autant de nucléases TALEN que de séquences d'ADN à hydrolyser. Cependant la synthèse du gène codant domaine de fixation à l'ADN pose des problèmes.

En conséquence, la conception et la synthèse de nucléases TALEN spécifiques de chaque séquence d'ADN cible s'est avérée trop lourde et trop chère.

b. Exemples de développements et d'applications de diverses techniques CRISPR

La technique CRISPR-Cas est promise a de multiples évolutions / adaptations, ce qui laisse entrevoir une multiplicité d'applications.

1er exemple : [CRISPR-Cas9 / cytidine désaminase]

Un système a été développé dans lequel la fusion [CRISPR-Cas9 / cytidine désaminase] conserve la capacité d'être dirigé par un ARN guide, n'induit pas de cassure double brin de l'ADN et convertit directement une cytidine en uridine (substitution C -> T ou G -> A) dans une fenêtre d'environ cinq nucléotides.

Voir : Komor et al. (2016)

2ème exemple : dCas9 = endonucléase Cas9 désactivée

dCas9 de S. pyogenes est une forme enzymatiquement inactive de Cas9 (mutation D10A dans le domaine RuvC1 et mutation H841A dans le domaine HNH). dCas9 ne peut donc pas hydrolyser l'ADN cible mais elle est toujours capable de le reconnaître et de le fixer par le biais de l'ARN guide et du motif PAM.

Applications dCas9 :

• régulation de la transcription de gènes guidée par un ARN (répression par interférence CRISPR ou activation par activation CRISPR). La fixation de dCas9 en aval du site de début de la transcription peut arrêter l'allongement de la transcription en bloquant l'ARN polymérase II ou en empêchant la fixation de facteurs de transcription.
• épigénétique
• contrôle de la transcription par fusion de dCas9 avec une protéine activable par certaines longueurs d'onde (optogénétique)
• cibler les ARN dans les cellules vivantes en fusionnant dCas9 à une protéine fluorescente. Les ARN ciblés fluorescents sont suivis dans la cellule, sans entraver leur mouvement ou leur fonction.

Voir : Dominguez et al. (2016) - Nelles et al. (2016)

3ème exemple : le système de type V CRISPR-Cpf1

Cpf1 : CRISPR from Prevotella and Francisella 1 - nucléase d'environ 1300 acides aminés.

• Acronymes : LbCpf1 : Lachnospiraceae sp. / AsCpf1 : Acidaminococcus sp. / FnCpf1 : Francisella novicida U112
• Cpf1 et Cas9 diffèrent du point de vue structural : Cpf1 contient deux domaines nucléase "RuvC-like" éloignés sur le plan structural du domaine RuvC de Cas9. De plus Cpf1 ne possède pas de domaine endonucléase HNH. Cpf1 pourrait donc hydrolyser les deux brins d'ADN en formant un dimère.
• Cpf1 fonctionne aussi comme une RNase pour maturer le pre-crRNA (acides aminés His843, His852 et Lys869).
• Il n'y a pas de tracrRNA à proximité de la matrice CRISPR.
• un crRNA de 42 - 44 nucléotides avec une séquence répétée directe d'environ 19 nucléotides suivie d'une séquence espaceur de 23 - 25 nucléotides est suffisante pour guider l'endonucléase Cpf1 vers l'ADN cible.
• le motif PAM pour Cpf1 est 5'-TT(T)N-3'.

Voir : Sontheimer & Wolfe (2015) - Dong et al. (2016) - Fonfara et al. (2016) - Yamano et al. (2016)

4ème exemple : recherche de paires de médicament anti-cancéreux

Les tumeurs deviennent souvent résistantes aux médicaments individuels. En revanche certaines combinaisons de médicaments peuvent détruire ces tumeurs résistantes.

Une méthode qui inactive systématiquement 2 gènes en même temps dans les cellules permet de chercher de telles combinaisons. Cette méthode est basée sur le système d'édition de gènes CRISPR-Cas9 (« CRISPR-based double knockout »).

• Des pools d'oligonucléotides ont été clonés séparément dans des vecteurs lentiviraux avec des promoteurs U6 humains (hU6) ou U6 de souris (mU6) pour générer 2 banques de sgRNA uniques.
• Puis 490,000 double sgRNAs (700 sgRNAs hU6 x 700 sgRNAs mU6) dirigés contre 21.321 paires de cibles potentielles de médicaments dans des cellules atteintes de leucémie (cellules K562) ont été étudiés pour rechercher des paires de médicaments qui fonctionnent de manière synergique.

L'inactivation de 2 gènes (BCL2L1 et MCL1) détruit les cellules résistantes : les médicaments qui inhibent les protéines codées par ces gènes détruisent plus de cellules leucémiques que ne le font chacun des deux médicaments séparément.

Voir : Han et al. (2017)

c. Les questions éthiques que soulève la technique CRISPR-Cas

Certaines applications de la technique CRISPR-Cas soulève de nombreuses questions sur le plan éthique, en particulier son application sur de l'ADN humain.

En 2015 et en 2017, des équipes chinoises (Liang et al., 2015 - Tang et al., 2017) ont utilisé CRISPR-Cas pour modifier le génome d'embryons humains. Cette approche a soulevé une vive controverse sur le plan éthique.

Cependant, les positions évoluent très rapidement : aucun pays ne veut être à la traine en regard des possibilités d'édition des gènes des systèmes CRISPR-Cas.

Exemples :

• Début 2016, l'équipe de Kathy Niakan (Francis Crick Institute - Grande Bretagne) ont obtenu la permission (décernée par "UK Human Fertilisation and Embryology Authority") de modifier les génomes d'embryons humains pour des travaux de recherche.
• Depuis la Suède et la Chine autorisent aussi ce type d'expérience.
• Une co-injection [ARN messager codant Cas9 / ARN guides / ADN donneur] a introduit l'allèle CCR5Δ32 d'origine naturelle dans des embryons humains zygotes 3PN (Kang et al., 2016).

Source : Ledford H. (2015)

En avril 2016, le département américain de l'agriculture a déclaré qu'il ne réglementera pas un champignon (Agaricus bisporus) génétiquement modifié avec le système CRISPR-Cas9 (Y. Yang n'a modifié que 2 nucléotides de l'ADN pour obtenir un variant plus résistant au brunissement dû à l'oxydation - enzyme polyphénol oxidase).

Le champignon peut maintenant être cultivé et vendu sans passer par le processus réglementaire de l'agence. C'est le premier organisme modifié par CRISPR-Cas9 à recevoir un feu vert du gouvernement américain.

Ci-dessous : organismes modifiés par le système TALEN (veau sans corne)

ou par le système CRISPR-Cas9 (chien hyper-musclé)

d. Bataille juridique concernant la paternité de la technique CRISPR-Cas

La technique CRISPR-Cas est également source d'une terrible bataille judiciaire en ce qui concerne la paternité (donc les brevets) de certaines applications, en particulier les techniques de "base".

Exemple de brevet : US8697359B1/ The Broad Institute - MIT / "CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products" F. Zhang (4/15/2014)

Cette bataille est d'autant plus importante :

• qu'elle engage les 3 principaux découvreurs qui ont également créé les principales entreprises de biotechnologie utilisant la technique CRISPR-Cas
• que cette technique est susceptible de rapporter des dizaines de milliards de dollars dans les années à venir
• que cette technique est applicable à tous les génomes, en particulier le génome humain (voir ci-dessus)

Février 2017 : l'Office des brevets et des marques des États-Unis (USPTO) publie un premier verdict en faveur de Broad Institute (Cambridge, Massachusetts) sur les droits à la technologie d'édition du génome.

Entreprises biotechnologiques :

• Emmanuelle Charpentier : CRISPR Therapeutics
• Jennifer Doudna & Feng Zhang : Editas
• Jennifer Doudna : Intellia Therapeutics

Ethique et controverse :

• Liang et al. (2015) "CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes" Protein & Cell 6, 363-372
• Ledford H. (2015) "Where in the world could the first CRISPR baby be born ?" Nature 526, 310 - 311
• Lanphier et al. (2015) "Don't edit the human germ line" Nature 519, 410 - 411
• Ledford H. (2016) "How the US CRISPR patent probe will play out" Nature 531, 149
• Ledford H. (2017) "Why the CRISPR patent verdict isn't the end of the story" Nature 542

Le Prix Nobel de Chimie 2020 a été attribué à Emmanuelle Charpentier & Jennifer Doudna " for the development of a method for genome editing".