1. Introduction

2. Exemple de protocole pour la préparation d'une banque normalisée et soustraite en une seule étape

3. L'épissage alternatif et ses conséquences sur les EST obtenues

4. Analyse des EST obtenues à partir du cerveau de l'abeille

5. Logiciels et bases de données utilisés

6. Puces à ADN

7. Résumé des résultats

8. Liens Internet et références bibliographiques

1. Introduction

L'article a été publié en 2002. Or le génome de l'abeille n'a été publié qu'en 2006. C'est la raison pour laquelle, dans cet article, l'annotation des gènes de l'abeille a été faite par rapport au génome de la Drosophile.

Source : Genome.gov

• Abeille : Eukaryota; Metazoa; Arthropoda; Hexapoda; Insecta; Pterygota; Neoptera; Endopterygota; Hymenoptera; Apocrita; Aculeata; Apoidea; Apidae; Apis; Apis mellifera
• Drosophile : Eukaryota; Metazoa; Eumetazoa; Arthropoda; Hexapoda; Insecta; Pterygota; Neoptera; Endopterygota; Diptera; Brachycera; Ephydroidea; Drosophilidae; Drosophilinae; Drosophilini; Drosophiliti

Le génome de l'abeille (environ 200 méga-bases) a été séquencé par une méthode en vrac ("shotgun") et clonage dans des BAC. Il est constitué de 16 chromosomes et 1 chromosome mitochondrial.

Les populations d'abeilles déclinent dans le monde entier. Par exemple, les apiculteurs américains perdent 30% de leurs colonies annuellement. Les abeilles sont des pollinisateurs critiques de nos cultures : ces pertes ont des conséquences majeures pour la viabilité de notre industrie agricole.

Vie et comportement social de l'abeille

Les abeilles sont des insectes sociaux, qui vivent en colonies qui peuvent contenir des dizaines de milliers d'individus.

La vie de la colonie est organisée via une sub-division des tâches complexe et sophistiquée.

• chaque colonie contient une seule reine, spécialisée pour la reproduction : elle pond des oeufs la majeure partie de son existence.
• les mâles (appelés "drones") sont relativement rares et leur rôle unique est de s'accoupler.
• la majorité des individus de l'essaim sont des abeilles ouvrières stériles. Elles sont responsables de toutes les autres tâches exécutées par la colonie.

Ces tâches sont réparties parmi les individus via le processus de maturation du comportement ("behavioral maturation ") :

• au cours des 2 à 3 premières semaines de leur vie adulte, les ouvrières se spécialisent dans les soins de la couvée ("pouponnage" - "nursing").
• elles passent alors à d'autres tâches plus spécialisées pendant quelques jours :
  1. construction des cellules en nid-d'abeilles
  2. stockage de la nourriture dans ces cellules
  3. garde de l'entrée de l'essaim contre les voleurs - agresseurs
  4. ...
• enfin, au cours des 1 à 2 semaines du reste de leur vie, les ouvrières partent à l'extérieur à la recherche de nectar et de pollen, sources uniques de nourriture pour la colonie.

Intéret d'étudier l'abeille : étude de la "plasticité" neuronale et comportementale de l'abeille en relation avec son comportement social, ses capacités d'apprentissage et de mémorisation.

Perspectives : implications des résultats en écologie et dans le domaine de l'évolution des espèces. Par extension, on peut mentionner l'importance économique de la pollinisation des fleurs et de la fabrique du miel par ce type d'abeille.

Justification de l'obtention d'un trés grand nombre d'EST ("expressed sequence tag") :

• En 2002, il n'y avait qu'un millier de séquences (gènes et EST) concernant l'abeille.
• Par ailleurs, l'intéret de l'analyse d'un grand nombre de gènes en parallèle avait été démontré par des profils d'expression caractéristiques de la differenciation entre abeille ouvrière et reine.

Matériel de départ : 600 cerveaux d'abeilles ouvrières d'âges différents (de 1 à 30 jours) ont été isolés pour l'obtention des ARN à l'origine des banques.

Source : Virtual Atlas of the Honeybee Brain

2. Exemple de protocole pour la préparation d'une banque normalisée et soustraite en une seule étape (Carninci et al., 2000)

Technique mise au point à l'institut "RIKEN" (Japon).

La stratégie repose sur :

• l'isolement d'ARNm abondants (normalisation) ou déjà isolés (soustraction), mais surtout nouveaux et rares.
• la synthèse du premier brin d'ADNc pleine longueur ("full-length cDNA") à partir de ces différents types d'ARN.
• une hybridation entre ces différents types de premier brin d'ADNc ("Tester cDNAs") et diverses populations d'ARNm ("Driver") biotinylés.

La normalisation et la soustraction sont effectuées en une seule étape.

L'hybridation entre acides nucléiques dépend de nombreux paramètres physico-chimiques. En particulier, la probabilité d'hybridation entre des séquences complémentaires augmente avec le temps de la réaction et la concentration en acides nucléiques. Pour tenir compte de ces 2 facteurs, on définit le produit (concentration x temps) appelé :

• R_oT pour l'hybridation ARN - ADN
• C_oT pour l'hybridation ADN - ADN

La valeur R_oT 1/2 correspond à 50% de molécules hybridées.

Banque d'ADNc de tailles sélectionnées ("size-selected cDNA library").

Les ADNc sont séparés sur gel d'agarose. Puis la partie du gel correspondant aux ADNc de tailles désirées est découpée et les ADNc sont élués du gel.

3. L'épissage alternatif et ses conséquences sur les EST obtenues

Les génes sont transcrits sous forme d'ARN messagers pré-matures (synonymes : transcrits primaires ou pré-ARNm) qui contiennent des introns (séquences de l'ARN pré-mature non retenues dans la séquence finale de l'ARN messager qui code la protéine) et des exons qui sont assemblés selon différentes combinaisons (épissage alternatif).

Les introns ont des tailles extrêmement variables : de plusieurs centaines de nucléotides à plusieurs centaines de milliers de nucléotides.

L'épissage alternatif est le processus qui permet à un même gène de générer différents transcrits selon la combinaison des exons qui formeront l'ARN messager mature.

L'épissage est effectué par deux réactions de trans-estérification au sein de complexes appelés spliceosomes formés, entre autres, de 5 particules ribonucléoprotéiques appelées SnRNP ("Small nuclear RiboNucleoProtein").

Ce sont des protéines associées à des petits ARN nucléaires ("small nuclear RNA" - snRNA) riches en uracile (U1, U2, U4, U5 et U6).

Figure ci-dessous : Les 5 types d'épissage alternatif

• 1 : site d'épissage alternatif 5'
• 2 : site d'épissage alternatif 3'
• 3 : rétention d'intron
• 4 : exclusion mutuelle d'introns
• 5 : exclusion / inclusion d'exon

Les répercutions de l'épissage alternatif sur les EST que l'on peut obtenir sont les suivantes :

Figure adaptée de "Précis de génomique", Gibson & Muse (2004)

• quand différents exons d'un même gène sont attachés au même dernier exon en 3' dans une collection d'EST, ils apparaissent comme des gènes distincts avant l'analyse.
• s'il existe plusieurs sites d'initiation de la transcription, on aboutit à différents EST pour un même gène.
• la probabilité que l'extrémité 5' d'un ADNc corresponde effectivement au site d'initiation décroît en fonction de la longueur du transcrit. En conséquence, les EST qui dérivent de l'extrémité 5' correspondent souvent à des séquences internes du gène.
• des erreurs peuvent être observées également à l'extrémité 3' : délétions internes ou erreurs d'épissage. Certains gènes possèdent plusieurs extrémités 3'.

Puisque les séquences des EST ne correspondent qu'aux extrémités 3' ou 5' des ADNc, des séquences distinctes d'EST issues d'un même gène peuvent être interprétées dans un premier temps comme issues de gènes différents.

La comparaison des EST et des séquences d'ADN génomique permet de lever cette ambiguïté et d'associer différents EST à un gène unique.

4. Analyse des EST obtenues à partir du cerveau de l'abeille

Remarque 1 : dans cette étude, la banque a été normalisée puis soustraite.

Remarque 2 : en 2012, la base de données UniGene (NCBI) contient plus de 190.000 EST et ARNm d'abeille regroupées en plus de 24.000 groupes ou "clusters".

Qualité des EST et correspondance avec des gènes

Source : Whitfield et al. (2002)

a. L'analyse avec BLAST (e-value ≤ e^-5) indique que, parmi ces 8912 séquences assemblées, 3501 (= 2616 + 885 / 39%) ont un homologue connu dans la base de données "Non-Redundant Protein (nr)".

b. Sur les 8912 séquences assemblées, 3449 possèdent une phase de lecture ouverte ("Open Reading Frame - ORF") d'au moins 450 paires de bases. Parmi ces séquences, 2616 (76%) ont un homologue connu dans la base de données "nr".

En d'autres termes, 833 (24%) gènes possibles codant des protéines et exprimés dans le cerveau de l'abeille n'ont pas d'homologues dans la base de données "nr" et seraient donc nouveaux.

Source : Whitfield et al. (2002)

c. Sur les 8912 séquences assemblées, 5463 possèdent une ORF inférieure à 450 paires de bases. Parmi ces séquences, 885 (16%) ont un homologue connu dans la base de données "nr".

d. En ce qui concerne les 4578 (84%) autres séquences qui ne correspondent à rien, diverses explications sont fournies :

• assemblage trop court de certains contigs
• décalage de la fenêtre de lecture
• troncation du côté 5' donc une teneur trés forte en 3'UTR
• intron riche en AT partiellement epissé
• insertion dans une orientation réverse
• séquence poly(A)+

Comparaison avec d'autres espèces

a. L'abeille et la drosophile sont toutes deux des arthropodes. En effet, l'analyse avec BLAST indique que, parmi les 3501 séquences assemblées qui ont un homologue connu dans la base de données "nr", 2245 (64%) sont similaires de séquences de protéines de la drosophile.

b. Une comparaison avec BLASTX indique que 3362 séquences d'EST assemblées de l'abeille sont homologues à 2672 séquences de la drosophile soit (19,6% de redondance). Sur la base d'une redondance d'environ 20% dans les 8912 séquences assemblées, les auteurs estiment que ces 8912 séquences représenteraient 7100 gènes exprimés.

Ils en concluent que : si l'abeille a le même nombre de gènes que la drosophile, ces 7100 gènes représenteraient 50% des gènes du génome de l'abeille.

Rappel : l'article a été publié en 2002. Or le génome de l'abeille n'a été publié qu'en octobre 2006.

Annotation fonctionnelle des séquences d'EST assemblées du cerveau d'abeille

Elle a été faite :

• avec les séquences ayant un degré d'homologie avec celle de la drosophile tel que e-value ≤ e^-5 (BLASTX)
• sur la base de l'annotation du génome de la drosophile (génome publié en 2000)
• sur la base de l'ontologie GO ("Gene Ontology") de la drosophile en utilisant les annotations de type ISS ("inferred from sequence similarity"), plus fiables que celles de type IEA ("inferred from electronic annotation") car curées manuellement

Résultats :

• tableau 3 : fonction des molécules
• tableau 4 : processus biologiques. 116 gènes sont liés à la transmission synaptique ("chemical synaptic transmission" - code GO : 0007268) et 42 gènes sont liés aucomportement ("behavior" ou "behaviour" - code GO : 0007610)
• tableau 5 : liste des 46 gènes (sur 116) de la drosophile liés à la transmission synaptique, ayant au moins un homologue dans les séquence assemblées de l'abeille (remarque : le texte mentionne 54 gènes)
• tableau 6 : liste de 47 gènes (sur 106*) de la drosophile liés au comportement, ayant au moins un homologue dans les séquence assemblées de l'abeille.

*En 2001, seuls 42 gènes de la drosophile étaient annotés comme liés au comportement. Pour augmenter ce nombre, les auteurs ont généré une liste de 106 gènes à partir de mutants de la drosophile ayant des modifications de différents aspects du comportement.

5. Logiciels et bases de données utilisés

• séquençage des EST par appel de base : programme Phred
• élimination des séquençes de vecteur : programme CrossMatch
• élimination des séquençes de faible qualité : programmes Qualtrim et Simpletrim
• masquage des séquençes répétées : programme RepeatMasker
• recherche d'homologie pour l'élimination de séquences contaminantes ou artéfactuelles : aller à la page d'accueil du programme BLAST (NCBI) - Choisir : "Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)" puis cliquer sur "Choose database " pour voir les bases de données interrogeables (nr, EST-human, ...)

Electrophoregramme obtenu par appel de base

• assemblage des EST en contig : programmes Phrap et CAP3
• recherche de phase de lecture ouverte ("open reading frame" - ORF) : programme Flip
• annotation des EST assemblées : base de données Gene Ontology
• analyse des images issues des puces à ADN : programme GenePix

Analyse du bruit de fond par le programme GenePix

6. Caractéristiques des échantillons pour les puces à ADN

Le but de cette analyse n'est pas une analyse transcriptomique classique, c'est-à-dire une comparaison des gènes différentiellement transcrits entre une condition témoin et une condition pathologique.

Cette analyse a pour but de valider le point suivant : la quantité d'ARN extraite d'UN cerveau d'abeille est-elle suffisante pour toute expérience ultérieure d'hybridation aux 2 longueurs d'onde (635 nm et 532 nm) ?

En effet, les ARN sont extraits de 2 cerveaux d'abeille puis l'échantillon est divisé en 2 aliquotes. Chacun est marqué par un fluorophore (Cy3 et Cy5). Les échantillons marqués sont mélangés et hybridés à la même puce. La fluorescence des puces sont lues aux 2 longueurs d'onde.

Les résultats du tableau 7 et de la figure 2 confirment la possibilité de ne travailler que sur un cerveau.

Choix des EST

• 8872 clones d'EST ont été choisis de sorte qu'ils représentent 7000 transcrits potentiels uniques.
• Au sein des contig, le choix de l'EST ayant une séquence d'au moins 300 paires de base entraîne une sur-représentation des 3'EST sur la puce mais permet de déposer sur la lame des sondes qui ont au moins cette taille.

Bétaine

La relation entre température de fusion et la composition en base des sondes est moins stricte en présence de bétaine. Ainsi, l'emploi de la bétaine dans les puces à ADN augmente (Diehl et al., 2001) :

• l'homogénéïté du dépôt des sondes (spots) sur la lame
• le signal d'hybridation (fluorescence)

Cibles

Les cibles sont des ARNm extraits d'un mélange de 2 cerveaux d'abeilles adultes puis amplifiés.

Le marquage est effectué au cours de la rétro-transcription des ARN : un échantillon aliquote est marqué au Cy3 et un autre échantillon aliquote est marqué au Cy5. Les 2 échantillons sont ensuite mélangés et hybridés aux sondes (p 560).

Amplification d'ARN : cette technique est utilisée pour la synthèse et le marquage de cibles pour des expériences de puces, quand la quantité de matériel de départ est limitante.

Un oligonucléotide qui contient la séquence du promoteur de l'ARN polymérase T7 est incorporé au cours de la synthèse du second brin d'ADNc. L'ARN polymérase T7 permet ensuite la synthèse d'un ARN antisens amplifié ("amplified antisense RNA" - "aRNA").

Remarque : dans cette étude, l'émission de fluorescence est suivie à 532 nm et 635 nm.

Source : Van Gelder et al., 1990

Contrôles

• contrôles négatifs externes ("exogenous controls 1-4" - voir aussi article p 560) :
  1. ADNc de la phosphoglycérate kinase et de la microglobuline de bétail
  2. ADNc de la RuBisCO et de la protéine fixant la chlorophylle de soja
• contrôles "spot" ("exogenous controls 5-48") : mélange de 43 ADNc de vertébrés déposés aléatoirement sur les puces

Données issues des puces à ADN

Les valeurs d'intensité de fluorescence ont été normalisées de sorte que la moyenne du rapport des intensités (635 / 532 nm) = 1. Les résultats des puces à ADN (tableau ci-dessous) confirment que la grande majorité des EST du cerveau sont issues de transcrits réellement exprimés dans le cerveau de l'abeille.

7. Résumé des résultats

Les transcrits potentiels ont été annotés sur la base des données disponibles en 2002 pour la drosophile.

• Les EST obtenues à partir du cerveau d'abeille sont liées à une large gamme de gènes impliqués dans des fonctions et des processus biologiques, notamment neurobiologiques.
• Environ 50% des séquences d'EST d'abeille sont liées à des gènes qui, chez la drosophile, sont impliqués dans la transmission synaptique et/ou le comportement.
• 24% des séquences d'EST d'abeille contenant une phase de lecture ouverte d'au moins 450 nucléotides semblent correspondre à des gènes nouveaux, liés à ces deux processus biologiques.
• Plus de 100 transcrits potentiels chez l'abeille, communs à d'autres organismes, ne semblent pas exister chez la drosophile.
• Les puces à ADN ont été fabriquées à partir de 7329 EST amplifiés (donnant une bande unique sur gel). Ces EST représentent différents transcrits potentiels. Avec une redondance de 20% dans les assemblages d'EST, les auteurs estiment que les 8912 assemblages correspondent à environ 7100 gènes exprimés dans le cerveau de l'abeille.
• Les résultats d'hybridation obtenus avec des cibles synthétisées à partir des ARNm d'un seul cerveau d'abeille mettent en évidence une expression de génes pour 90% des ADNc (sondes) de l'abeille avec un rapport d'intensité (log2(r)) deux fois supérieur à ceux obtenus avec des cibles issues d'un ADN contrôle externe.

Conclusions - perspectives

Beaucoup de phénomènes liés au comportement chez l'abeille ne sont pas observés chez la drosophile. De plus l'abeille est haplo-diploïde et a le taux de recombinaison le plus élevé connu chez les animaux.

Séquence abeille - gène du comportement : CAM Kinase II / Fichier Unigene BB170005A10D08

Pour mieux corréler l'expression de certains gènes au comportement de l'abeille :

• génome de l'abeille
• atlas du cerveau de l'abeille : travaux du groupe de R. Menzel
• étude d'abeilles transgéniques

Exemples de continuité de ce travail : Nunes et al. (2004); Whitfield et al. (2006).

Approches complémentaires plus récentes :

• via les miRNA : voir Greenberg et al. (2012)
• via la protéomique - spectromètrie de masse : voir Baker et al. (2012)