1. Introduction

2. Première étape du cycle : la ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase - oxygénase ou RuBisCO

a. Détail de la réaction catalysée par la RuBisCO

b. Structure oligomèrique de la RuBisCO des Plantes supérieures

c. Site actif de la RuBisCO

d. Modulation de l'activité de la rubisco par la RuBisCO activase

3. Réaction de carboxylation vs. réaction d'oxygénation (la photorespiration)

4. Biosynthèse des sous-unités de la RuBisCO

5. Les autres étapes du cycle RPP

6. Régulation du cycle RPP

7. Application : étude protéomique de la RuBisCO

8. Liens Internet et références bibliographiques

1. Introduction

Les réactions photochimiques de la photosynthèse forment de l'ATP et du NADPH + H⁺ qui vont permettre la réduction du CO₂ en glucides (CH₂O) par des réactions thermochimiques.

• Ces réactions nécessitent un accepteur qui forme avec le CO₂ un groupe carboxyl puis l'intègre dans un glucide.
• Cet accepteur doit être régénéré pour que le processus de fixation perdure. Cette régénération requiert un temps minimal.
• La quantité de cet accepteur doit aussi augmenter durant la croissance des végétaux de façon à ce que toujours plus de matière soit formée.

Le cycle de Benson, Calvin & Bassham répond à ces critères.

Dans la littérature, ce cycle est dénommé de diverses manières :

• cycle réductif (réducteur) des pentoses phosphate ou cycle RPP (à ne pas confondre avec la voies des pentoses phosphate)
• cycle photosynthétique de réduction du carbone
• voie en C3 (qui précise que son premier intermédiaire est ose à 3 carbones)
• cycle de Calvin / cycle de Calvin - Benson / cycle de Calvin - Bassham

Ce cycle est basé sur les travaux de Ruben (datant de 1930) puis ceux de Kamen et Bassham.

Melvin Calvin (1911-1997) a reçu le Prix Nobel en 1961 pour ses travaux sur la photosynthèse et l'assimilation du CO₂. Voir le montage de la "lollipop", dispositif de Melvin Calvin, Andrew Benson et James Bassham (CalTech - 1950) contenant des chlorelles (Chlorella vulgaris).

Cette phase ne nécessite pas de lumière contrairement aux réactions photochimiques de la phase lumineuse. Cependant, chez la plupart des végétaux, le cycle de Calvin se déroule de jour afin que les réactions photochimiques régénèrent l'ATP et le NADPH + H⁺nécessaires à la synthèse des glucides.

2. Première étape du cycle - La ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase - oxygénase ou RuBisCO

a. Détail de la réaction catalysée par la RuBisCO

Le CO₂ atteint directement les cellules photosynthétiques par diffusion ou, chez les Plantes supérieures, via des structures de l'épiderme foliaires appelés stomates.

L'incorporation du CO₂ est la première étape du cycle RPP. Elle est catalysée par la ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase - oxygénase ou RuBisCO : 3-phospho D-glycérate carboxy-lyase - E.C.4.1.1.39.

La RuBisCO représente environ 50% des protéines totales des feuilles, ce qui en fait l'enzyme la plus abondante de la biosphère.

La RuBisCO ne catalyse la fixation du CO₂ qu'à l'état activé, c'est-à-dire :

• sous une illumination convenable
• en présence de CO₂ (concentration optimale : 10 µM)
• et de Mg²⁺ (concentration optimale : 5 à 10 mM)
• quand le pH du stroma est de 8 au moment du pompage de protons.
• quand une molécule de CO₂ autre que celle qui sert de substrat réagit avec la chaîne latérale de la lysine 201 (voir ci-après).

Figure ci-dessous, la réaction d'incorporation du CO₂ (substrat) sur un ose phosphorylé à 5 carbones : le ribulose 1,5-bisphosphate (RuBP) .

La concentration des intermédiaires du cycle RPP détermine celle du RuBP.

Remarque : dans le cycle RPP complet, ce sont 3 molécules de CO₂ qui sont incorporées avant que le plus petit intermédiaire en C3 (le glycéraldéhyde 3-phosphate) ne quitte ce cycle.

b. Structure oligomèrique de la RuBisCO des Plantes supérieures

Chez les Plantes supérieures, la RuBisCO est une protéine oligomérique constituée de 16 sous-unités :

• 8 grosses sous-unités catalytiques (nomenclature : L) d'environ 55 kDa chacune (environ 446 acides aminés)
• 8 petites sous-unités (nomenclature : S) d'environ 14 kDa chacune (environ 123 acides aminés)

La masse molaire totale est environ 560 kDa pour une stoechiométrie L₈S₈.

Les 8 sous-unités L forment un "coeur" octamérique entouré par 2 "couches" de 4 sous-unités S, chaque couche se situant sur les 2 côtés opposés de la macromolécule.

Code : MMDB 6150 - Code : PDB 1RCX - Remarque : on dénombre olusieurs dizaines de structures de RuBisCO dans la PDB.

Chez les phototrophes autres que les Plantes supérieures, la structure quaternaire de la RuBisCO est variable. Par exemple, chez la bactérie poupre Rhodospirillum rubrum, c'est un homodimère dont les chaînes polypeptidiques ont une séquence homologue à 30% de celle de la grande sous-unité des Plantes supérieures.

c. Site actif de la RuBisCO

Les 8 sites actifs de la RuBisCO sont organisés autour d'un ion magnésium (en vert dans la figure ci-dessous).

Source : "RuBisCO : molecule of the month" - PDB : 8RUC

• Au dessus de cet ion est représentée une molécule de 2-carboxy-arabinitol bisphosphate, un sucre inhibiteur de la RuBisCO, analogue structural du 3-phosphoglycérate (le produit de la réaction catalysée par la RuBisCO).
• L'ion magnésium est fortement ligandé à 3 résidus d'acides aminés dont la lysine modifiée 201.

L'état activé de la RuBisCO est obtenu quand une une autre molécule de CO₂ que celle qui sert de substrat réagit avec la chaîne latérale de la lysine 201 , formant ainsi un carbamate (E-NH-CO₂^-) stabilisé par Mg²⁺ (E-NH-CO₂^-. Mg²⁺).

Le Mg²⁺ établit aussi une liaison avec le groupe β-COO^- de l'aspartate 203.

• Le rôle du Mg²⁺ est donc de neutraliser les charges négatives des résidus acides qui tendent à dissocier le carbamate.
• Motif du site actif : G-x-[DN]-F-x-K-x-D-E

En conséquence le rôle de cette molécule de CO₂ est trés particulier : c'est une molécule activatrice et non pas une molécule substrat de la réaction enzymatique. En effet, elle est :

• Fixée à la RuBisCO dans la journée activant ainsi l'enzyme.
• Relarguée la nuit, mettant ainsi en "sommeil" la RuBisCO.

En conséquence, la nuit, l'ion magnésium peut se fixer à la fois :

• À 2 atomes d'oxygène du RuBP (petites sphères rouges du sucre analogue structural).
• À la molécule de CO₂ de la réaction enzymatique, elle-même attachée au sucre.

Voir une application : étude protéomique de la RuBisCO.

d. Modulation de l'activité de la rubisco par la RuBisCO activase

1. La forme déprotonnée de la lysine 201 (E-NH₂) réagit avec le CO₂ (activateur) relarguant un proton et formant un carbamate (E-NH-CO₂^-) stabilisé par Mg²⁺ (E-NH-CO₂^-. Mg²⁺) (figure ci-dessous).

2. La RuBisCO est alors dans sa forme active [encadré bleu de la figure ci-dessous] et fixe le ribulose-1,5-bisphosphate (RuBP) pour former le complexe ternaire (E-NH-CO₂^- . Mg²⁺ . RuBP). RuBP est converti en intermédiaire ènediol.

Le CO₂ ou l'O₂ peuvent se fixer au site actif selon que la réaction catalysée est la carboxylation (CO₂ substrat), ou l'oxygénation (O₂ substrat).

Source : "Rubisco Activase"

3. La forte affinité du ribulose-1,5-bisphosphate pour la forme libre de la RuBisCO (E-NH₃⁺) génère le complexe abortif (E-NH₃⁺ . RuBP) ce qui favorise la formation d'une forme de RuBisCO non-catalytique.

4. Sous un éclairement intense, la RuBisCO activase interagit de manière non covalente avec ce complexe binaire (E-NH₃⁺ . RuBP) et facilite le relarguage du ribulose-1,5-bisphosphate [encadré rouge] libérant ainsi l'enzyme pour le cycle suivant de carbamylation.

La RuBisCO activase abaisse le K_M pour le CO₂ de 12 µM à 2 µM ce qui facilite la réaction de carbamylation.

L'importance de ce processus est que la vitesse à laquelle la RuBisCO activase augmente l'activité catalytique de la RuBisCO est liée à l'hydrolyse de l'ATP : 50 molécules d'ATP hydrolysées par site activé de RuBisCO.

Il existe 2 isoformes de RuBisCO activase (42 kDa et 46 kDa) qui diffèrent au niveau de leurs extrémités C-terminales du fait d'un épissage alternatif de leur pré-ARN messager commun.

3. Réaction de carboxylation vs. réaction d'oxygénation (la photorespiration)

Comme son nom l'indique, la RuBisCO catalyse en fait 2 réactions :

• carboxylation : RuBP + CO₂ -> intermédiaire en C6 -> 2 x 3-phosphoglycérate
• oxygénation ou photorespiration : RuBP + O₂ -> intermédiaire en C5 -> 3-phosphoglycérate + 2-phosphoglycolate + H₂O

Chez l'algue verte, Chlamydomonas reinhardtii, la boucle entre l'hélice α6 et le feuillet β6 du tonneau α/β du site actif (acides aminés 328 à 342 - PDB : 1GK8) joue un rôle clé dans la discrimination entre les 2 gaz substrats de la RuBisCO, CO₂ et O₂.

Cette boucle adopte une conformation "fermée" ou "ouverte" en présence ou en absence, respectivement, des substrats.

Il y a donc compétition entre le CO₂ et l'O₂ pour le même site de fixation et les vitesses des réactions de carboxylation et d'oxygénation sont conditionnées par les concentrations relatives des deux gaz dans l'atmosphère (tableau ci-dessous).

Cette inhibition de la photosynthèse par l'O₂ est appelé effet Warburg (1920).

Il y a 0,035 % de CO₂ dans l'air qui, une fois dans les stomates, n'est plus présent qu'à 0,01 %.

Pour un bon fonctionnement de la photosynthèse, il faudrait que la RuBisCO ait une trés forte affinité pour son substrat CO₂. Ce n'est pas le cas puisqu'il faudrait que l'air contienne 6% de CO₂ pour que la moitié de la vitesse maximale de la réaction de carboxylation soit atteinte.

In vivo (c'est-à-dire pour des concentrations : 250 µM O₂ et 10 µM CO₂), l'activité de carboxylation est cependant 3 à 5 fois celle de l'activité d'oxygénation.

• En effet, la réaction de carboxylation est facilitée car ΔG°'(carboxylation) = - 35 kJ. mol^-1.
• En d'autres termes, la fixation du CO₂ est (quasiment) irréversible ce qui compense la faible affinité de la RuBisCO pour le CO₂.

4. Biosynthèse des sous-unités de la RuBisCO

• Les petites sous-unités sont codées par le génome nucléaire.
• Les grosses sous-unités catalytiques sont codées par le génome du chloroplaste.

L'assemblage via des molécules chaperonnes a lieu dans le chloroplaste.

Adaptée de : "Physiologie végétale" (1995) - Laval-Martin & Mazliak

Cette caractéristique reflète peut-être les origines endosymbiotiques de cet organite.

5. Les autres étapes du cycle RPP

Le cycle RPP contient 13 réactions.

Source : "Principes de Biochimie" Horton et al. (1994)

Le cycle RPP peut se décomposer de manière schématique en 3 phases (figure ci-dessous) :

• la carboxylation du RuBP (RuBisCO)
• la phase de réduction qui permet la synthèse du premier glucide : le glycéraldéhyde 3-phosphate
• la régénération du RuBP. Cette partie est plus complexe du point de vue stoechiométrique car le glycéraldéhyde 3-phosphate se répartit en 3 branches qui font intervenir des trioses, des pentoses, des hexoses et des sédoheptuloses

Réduction du 3-phosphoglycérate (APG)

Cette réaction synthétise le premier glucide de la photosynthèse en 2 étapes :

• a. La phosphorylation par l'ATP de l'APG en 1,3-diphosphoglycérate par la 3-phosphoglycérate kinase (47 kDa). Cette enzyme catalyse la réaction réverse dans la glycolyse.
• b. La réduction du 1,3-diphosphoglycérate en glycéraldéhyde 3-phosphate par la NADP⁺ glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (600 kDa). Cette enzyme est activable par la lumière.

L'ATP et le NADPH sont formés lors des phases lumineuses de la photosynthèse.

Régénération du RuBP à partir du ribulose 5-phosphate (RuP)

Cette régénération utilise les 5/6ème des trioses phosphate synthétisés. Quand le stock de RuBP est seulement renouvelé, 1/6ème au mieux des trioses peut fournir des réserves glucidiques d'origine photosynthétique à la plante.

La phosphoribulokinase (EC 2.7.1.19) a un K_M de 0,2 mM et 0,1 mM pour le ribulose 5-phosphate (RuP) et l'ATP, respectivement (les concentrations chloroplastiques de ces substrats étant de 0,1 mM et 2 mM, environ).

La valeur : ΔG°'(RuP -> RuBP) = - 21,8 kJ. mol^-1 indique que la formation du RuBP est fortement favorisée.

Bilan du cycle RPP : 6 CO₂ + 18 ATP + 12 [NADPH + H⁺] + 11 H₂O -> fructose 6-phosphate + 18 ADP + 12 NADP⁺ + 17 Pi

La réduction de 1 CO₂ en glucide nécessite donc 3 ATP et 2 [NADPH + H⁺]

6. Régulation du cycle RPP

Le contrôle du cycle a lieu aux étapes irréversibles, en particulier les réactions catalysées par : la fructose 1,6-bisphosphatase, la sédoheptulose 1,7-bisphosphatase, la phosphoglycérate kinase, la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase et la phosphoribulokinase.

Ces enzymes sont contrôlés par l'intensité lumineuse (sauf la phosphoglycérate kinase), le taux de Mg²⁺ du stroma et le pH.

L'activation par la lumière met en jeu la réduction de ponts disulfure à la surface de ces enzymes, qui modifie leur structure (figure ci-dessous).

Adaptée de : "Principes de Biochimie" Horton et al. (1994)

• La ferrédoxine cède ses électrons à une thiorédoxine située dans le stroma.
• La thiorédoxine contient 2 groupements sulfhydryle qui peuvent être réduits (groupe thiol : -SH) ou oxydés (disulfure).
• La réduction des groupements sulfhydryle est catalysée par une ferrédoxine-thiorédoxine réductase.
• Le groupe thiol formé sur la thiorédoxine est spontanément échangé avec un disulfure de la surface d'une enzyme contrôlée par la lumière. La réduction de ce groupe active l'enzyme sensible à la lumière.

On notera que les électrons et protons nécessaires à ces réductions sont fournis par la chaîne de transport d'électrons photosynthétique.

Ces réductions sont non cycliques et situées du côté oxydant de l'accepteur primaire d'électrons.

C'est un exemple de l'utilisation des réactions photochimiques dans un autre but que la synthèse d'ATP et de NADPH.