1. Le monde à ARN

2. Le monde prébiotique - les expériences de Stanley Miller

a. Le ribose
b. Modèle de l'évolution chimique de la vie
c. Le proto-ARN : hypothèses complémentaires au monde à ARN

3. Les ribonucléotides et l'acide ribonucléique (ARN)

a. Structure générale
b. La liaison phosphodiester et la synthèse de la chaîne nucléotidique
c. Modifications chimiques de l'ARN
d. Les bases modifiées des ARN de transfert (ARNt)
e. Exemples de systèmes d'édition des bases des ARN

4. Les différents types d'ARN et leurs rôles

5. L'ARN est un catalyseur

6. Les ribozymes

a. Familles de ribozymes auto-clivants
b. Mécanisme catalytique des ribozymes auto-clivants

7. Les introns du groupe II (ribozyme)

a. Hypothèse d'un mécanisme évolutif commun au spliceosome et aux introns du groupe II
b. Rôle du lariat dans l'épissage des introns de groupe II

8. Les riboswitches

a. les classes de riboswitches
b. Mécanisme

9. Le dernier ancêtre commun universel (LUCA)

10. Liens Internet et références bibliographiques

1. Le monde à ARN

Le terme "RNA world" - "monde à ARN" a été employé pour la première fois en 1986 par Walter Gilbert (texte ci-dessous) qui s'intéressait principalement à la manière dont l'ARN catalytique aurait pu donner naissance à la structure exon-intron des gènes.

Source : Gilbert W. (1986)

L'idée avait été préalablement formulée par Alexander Rich en 1962 et Carl Woese en 1967.

Walter Gilbert a reçu le Prix Nobel de chimie en 1980 avec Fréderick Sanger "for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids."

Le monde primitif à ARN est une époque hypothétique où l'ARN servait à la fois d'information et de fonction, à la fois de génotype et de phénotype. Il s'agirait d' une période dans l'histoire primitive de la Terre (il y a environ 4 milliards d'années) au cours de laquelle la substance vivante primaire était l'ARN (ou une molécule chimiquement similaire).

Ci-dessous, modèle "monde à ARN" de l'apparition successive d'ARN, de protéines et d'ADN au cours de l'évolution de la vie sur Terre.

Source : Cech T.R. (2012)

De nombreux mélanges isolés de molécules organiques complexes (contenant entre autres des acides aminés et des peptides courts) n'ont pas réussi à s'auto-répliquer et sont donc morts (flèches vers l'extinction - les points).

La voie qui a conduit à l'ARN auto-répliquant a été préservée chez ses descendants modernes. Les flèches à gauche de l'ARN auto-répliquant représentent les systèmes hypothétiques capables de se répliquer qui ont précédé l'ARN.

Les protéines assez grosses pour se replier automatiquement et posséder une fonction ne sont apparues que lorsque l'ARN était disponible pour catalyser la formation de la liaison peptidique (polymérisation d'acides aminés).

LUCA ("Last Universal Common Ancestor" - dernier ancêtre commun universel) possédait déjà un génome à ADN et effectuait une biocatalyse à l'aide d'enzymes protéiques ainsi que d'enzymes ribonucléoprotéiques (comme le ribosome) et de ribozymes.

Le monde à ARN est une hypothèse pour laquelle on accumule de plus en plus de preuves mais qui demeure malgré tout une hypothèse.

Les ribozymes

• Les ribozymes participent à la synthèse de protéines via l'activité des ribosomes : la grande sous-unité ribosomale contient des ARN qui catalysent la réaction de transfert peptidyle.
• Les ribozymes participent à l'épissage des ARN et d'autres processus de maturation.
• La sous-unité ARN catalytique du complexe ribonucléoprotéique RNase P modifie les extrémités 5' des ARN de transfert.
• Certains ribozymes nucléolytiques sont impliqués dans la réplication en cercle roulant des génomes d'ARN, dans la modification co-transcriptionnelle des rétrotransposons et dans la régulation de la transcription des gènes chez les bactéries.

D'autres rôles biologiques des ribozymes restent à découvrir et/ou à étudier.

2. Le monde prébiotique - les expériences de Stanley Miller

En 1952, Stanley Miller (Université de Chicago, Illinois) a effectué des expériences capitales. Des décharges électriques (simulant la foudre) ont été envoyées dans un ballon rempli d'un mélange de gaz (vapeur d'eau, hydrogène, méthane et ammoniac) censé ressembler à l'atmosphère primitive de la Terre. Au bout d'une semaine, ce traitement avait converti une partie substantielle des gaz, non pas en un mélange aléatoire de molécules organiques, mais en un nombre restreint de composés importants sur le plan biochimique : en particulier les acides aminés (nécessaires à la synthèse de protéines), des hydroxyacides et l'urée.

Ces expériences (S. Miller a effectué plusieurs montages) ont été répétées et les 22 acides aminés ont été détectés (Johson et al., 2008).

Les produits obtenus par S. Miller ont pu constituer le mélange à l'origine des biomolécules, qu'on appelle la soupe primordiale ou soupe primitive ou soupe prébiotique.

• Ces résultats ont apporté les premiers éléments de modèles décrivant comment la vie a pu débuter sur terre. Leur publication a ainsi ouvert l'ère moderne de l'étude de l'origine de la vie.
• Dernière évaluation : microorganismes fossilisés potentiels de 4,28 milliards d'années (Dodd et al., 2017) isolés dans des roches sédimentaires de la ceinture de Nuvvuagittuq (Québec, Canada).

L'article de S. Miller a été publié quelques semaines seulement après l'article de J. Watson et F. Crick sur le modèle d'ADN à double hélice. Le lien entre les deux champs naissants a été établi après qu'il fût démontré que l'adénine (base nucléique de l'ADN et de l'ARN) peut être synthétisée par oligomérisation du cyanure d'hydrogène. On peut y voir les prémices des propositions d'un monde à ARN (Carl Woese, Leslie Orgel, Francis Crick, Walter Gilbert).

L'hypothèse du monde à ARN sous-tend que les liaisons établies entre les nucléotides libres au sein de la soupe prébiotique auraient été fréquemment rompues du fait de leur faible niveau d'énergie. Certains enchaînements de paires de bases avec des propriétés catalytiques modifiant le niveau énergétique de la chaîne créée, seraient restés formés plus longtemps. Au fur et à mesure que ces chaîne s'allongeaient, elles intégraient davantage de nucléotides et plus rapidement : la formation de ces chaînes devint ainsi plus rapide que leur dissociation.

a. Le ribose

Le ribose est synthétisé par la voie des pentoses phosphates.

Le β-D-ribose-5-phosphate et le β-2-désoxy-D-ribose-5-phosphate sont les deux oses constitutifs des acides nucléiques: ARN et ADN, respectivement.

L'étude des réactions dans des conditions imitant les cycles [pluie / évaporation] sur la terre primitive ont permis d'identifier 3 candidats potentiels pour les bases du proto-ARN : l'acide barbiturique, la mélamine et la 2,4,6-triaminopyrimidine. En effet, les réactions de ces molécules avec le ribose produisent des nucléosides.

Le mécanisme le mieux étudié pour la synthèse prébiotique du ribose est la réaction de formose (A. Boutlerov, 1861; R. Breslow, 1959) qui consiste en une série de polymérisations du formaldéhyde (H₂C=O) commençant par une conversion très lente de 2 molécules de formaldéhyde en glycolaldéhyde (O=HCH₂OH), suivies d'une fixation rapide de HCHO qui forme des glucides intermédiaires vers des mélanges plus complexes.

Cette réaction n'explique cependant pas la synthèse primitive de la molécule ARN.

Des chercheurs de la NASA ont synthétisé le 2-désoxyribose et plusieurs de ses dérivés par l'irradiation avec des UV de mélanges de glaces composés de H₂O et de CH₃OH (Nuevo et al., 2018). Ces dérivés s'ajoute à l'inventaire des composés d'intérêt biologique pouvant se former dans des conditions astrophysiques, d'autant qu'ils ont été récemment identifiés dans des météorites carbonées.

De nombreux travaux sont menés par les agences spatiales, en particulier la NASA ("National Aeronautics and Space Administration"). En effet, l'exobiologie (ou astrobiologie) est la science qui étudie les processus qui ont mené / mènent à l'apparition de formes de vie extra-terrestres. Ces données permettent d'obtenir des indices pouvant expliquer comment celle-ci est apparue sur Terre.

Voir un cours sur les glucides.

b. Modèle de l'évolution chimique de la vie

La figure ci-dessous décrit l'évolution chimique sous forme d'ensembles de réactions en 4 étapes :

• (1) condensation de composés inorganiques en précurseurs organiques réactifs
• (2) conversion des précurseurs en blocs de construction biologiques
• (3) formation de polymères par déshydratation / condensation de leurs monomères respectifs
• (4) émergence et développement de fonctions biologiques selon une évolution Darwinienne aboutissant à l'origine de la vie

Source : Kitadai & Maruyama (2018)

Phase gazeuse réductrice (flèches brunes); pH alcalins (flèches rouges); températures de congélation (flèches roses); eau douce (flèches bleues); cycles [sec / sec-humide] (flèches oranges; couplage avec des réactions à haute énergie (flèches grises); cycles [chauffage - refroidissement dans l'eau] (flèches vertes).

• Les réactions en phase gazeuse génèrent divers composés simples et très polyvalents, notamment : HCN (molécule 14), H₂C=O (31), cyanogène (8), cyanamide (18), cyanoacétylène (24), acroléine (58) et phénylacétylène (61) par l'action de l'éclairage et du rayonnement (UV, rayons X, ...)
• Un pH alcalin (8 - 10) favorise la conversion de HCN en formamidine (4), diaminomaléonitrile (5), formamide (9), aminomalononitrile (10), urée (13) et guanidine (20).
• La production de formose de ribose à partir de H₂CO (31) nécessite un pH alcalin (10 - 11) avec le calcium comme catalyseur au stade initial (glycolaldéhyde 32).
• Précurseurs organiques clés : HCN (14), cyanogène (8), formamide (9), cyanoacétaldéhyde (21) et cyanoacétylène (24).
• Cations métalliques : Cu²⁺, Fe²⁺, Mg²⁺, Pb²⁺ et Zn²⁺. Les métaux dissous entraînent également une précipitation du phosphate.
• Synthèse de ribonucléotides pyrimidines à partir de cyanamide (18), de cyanoacétylène (24), de glycéraldéhyde (27) et de glycolaldéhyde (32).

Les acides aminés sont formés à partir de précurseurs organiques simples dans les systèmes minéraux d'oxy-hydroxyde de fer contenant des gradients géochimiques. Les gradients rédox et de pH ont un impact sur les réactions car les acides aminés ne se forment que lorsque le minéral contient du fer oxydé et du fer réduit et que la solution environnante est alcaline. Les systèmes aqueux de fer partiellement réducteurs, probablement fréquents dans les fonds océaniques et les évents sous-marins de la Terre primitive, auraient pu faciliter la synthèse et la concentration de molécules organiques prébiotiques propres à l'émergence de la vie (Barge et al., 2019).

c. Le proto-ARN : hypothèses complémentaires au monde à ARN

On suppose que la vie a pour origine un ensemble de petites molécules prébiotiques présentes dans les comètes (exemple : C/1996 B2 Hyakutake) et dans l'atmosphère primitive de la Terre. L'hypothèse du monde à ARN postule que ces molécules se sont assemblées pour former des nucléosides puis des polymères portant une information capables de se répliquer.

L'hypothèse du monde à hydrocarbures aromatiques polycycliques ("Polycyclic aromatic hydrocarbons" - PAH) a été proposée par S. Platts (2004) puis sophistiquée par Ehrenfreund et al. (2006) pour expliquer comment les premières molécules d'ARN ont pu être formées. Les PAH sont en effet abondantes dans l'univers et donc, l'ont probablement été dans la soupe primitive.

Selon les chercheurs, l'ARN serait un produit de réactions non enzymatiques et prébiotiques ou un produit de l'évolution chimique et/ou biologique. Pour démontrer une synthèse plausible prébiotique de l'ARN, il faut admettre l'hypothèse selon laquelle la vie aurait commencé avec un polymère ancestral semblable à l'ARN appelé proto-ARN. L'identification de la structure chimique de ce proto-ARN (et des formes intermédiaires) nécessiterait d'explorer d'un nombre inouï tant de blocs de construction possibles du proto-ARN que de réactions prébiotiques.

Les résultats obtenus dans la recherche d'un proto-ARN issu de l'auto-assemblage moléculaire montrent que des modifications de la structure des blocs de construction de l'ARN (par exemple, la substitution de l'uracile par l'acide barbiturique) atténuent certains problèmes associés à la recherche d'une synthèse prébiotique de l'ARN (Cafferty et al., 2018).

3. Les ribonucléotides et l'acide ribonucléique (ARN)

a. Structure générale

La molécule d'ARN est un polymère linéaire composé de 4 nucléotides : l'adénosine monophosphate (AMP), l'uridine monophosphate (UMP), la guanosine monophosphate (GMP) et la cytidine monophosphate (CMP). Chaque nucléotide est constitué d'une base aromatique plane attachée à un ribose (cycle furanose) et d'un groupe 5'-phosphate.

La ribothymidine est trouvée essentiellement dans la boucle T des ARN de transfert (ARNt) à laquelle elle donne son nom. Lors de la transcription, une uridine est incorporée en position 54 dans le précurseur de l'ARNt puis cette uridine est modifiée par l'ARNt (uracile(54)-C(5))-méthyltransférase (EC 2.1.1.35) en ribothymidine. Elle joue un role important dans la stabilisation de la structure 3D des ARNt.

Conséquence du groupe hydroxyle 2'OH du ribose

Ce groupe induit de profondes différences entre l'ADN et l'ARN. Principalement parce qu'il rend la molécule d'ARN moins stable chimiquement que la molécule ADN en facilitant les réactions d'auto-clivage :

• La molécule ADN (le génome) est donc mieux adaptée à la conservation de génération en génération de l'information génétique.
• Le caractère transitoire de la molécule d'ARN se prête davantage à un rôle d'adaptateur dynamique aux changements d'état de la cellule.

La chimie prébiotique suppose que l'équilibre entre le clivage et la ligation des ARN a été déterminant :

• dans l'assemblage spontané des premiers ARN en absence de modèle
• dans l'apparition de l'évolution Darwinienne basée sur la compétition entre variants de séquence pour les ressources chimiques

Le groupe 2'-OH est un donneur et un accepteur de liaison hydrogène : il stabilise de nombreux types de paires de bases [non Watson-Crick] (non canoniques) que l'on ne trouve pas dans l'ADN et il facilite ainsi le compactage des hélices d'ARN. L'évolution s'est appuyée sur les propriétés d'auto-interaction de l'ARN pour générer un très grand nombre de structures très diverses capables d'établir des interactions spécifiques ARN - ARN, ARN - protéine, ARN - ADN, ARN - petite molécule ou ARN - ion.

Les différents types d'appariements des paires de bases

Les paires de bases de type Hoogsteen (Karst Hoogsteen) ont des caractéristiques structurales différentes des paires de bases de type Watson - Crick. L'angle entre les 2 liaisons glycosidiques (environ 80° dans la paire A - T) est plus grand et la distance C1' - C1' (environ 8,6 Å) est plus petite. Dans le cas des paires de bases de type Hoogsteen inversé, une base est tournée de 180° par rapport à l'autre.

Une paire de bases de type wobble est un appariement entre 2 nucléotides dans les molécules d'ARN qui ne suit pas les règles des paires de bases de type Watson - Crick. Les 4 principales paires de bases de ce type sont : G - U, hypoxanthine - U, hypoxanthine - A et hypoxanthine - C.

Quelques exemples de structures secondaires et tertiaires de l'ARN

Source : Blythe et al. (2016)

• En haut, petite région située à l'extrémité 5' du long ARN non codant ("long ncRNA" - voir ci-dessous) de B2-SINE.

• "Triple helix" : une région double brin de l'élément d'expression et de rétention nucléaire ("Expression and Nuclear retention Element" - ENE) séquestre la queue poly-A de l'ARN (en magenta) par des interactions de type Watson - Crick et de type Hoogsteen qui aboutissent à une triple hélice stabilisante (PDB 3P22).

• "Kissing loop" : boucle entre le substrat [tige-boucle] et le domaine catalytique [tige-boucle] par le ribozyme Neurospora Varkud satellite (voir ci-dessous - PDB 2MI0). Les 3 paires de bases de type Watson - Crick responsables de l'interaction entre les deux boucles sont en pointillés.

• Pseudonœuds ("pseudoknot") : interactions réciproques entre 2 [tiges-boucles] où la boucle de chaque [tiges-boucles] forme la tige de l'autre (PDB 1A60 - virus de la mosaique jaune du navet). Les paires de bases de type wobble et de type non Watson - Crick sont représentées par des cercles vides et pleins, respectivement.

Les différents niveaux de structure des ARN

La structure de certains types d'ARN peut être décrite par leur structure primaire, secondaire, tertiaire, voire quaternaire comme dans le cas des protéines.

• La structure primaire d'un ARN est la séquence de ses nucléotides.

• La capacité des brins dARN à apparier des bases (canoniques de type Watson - Crick ou non canoniques tel que le wobble G:U) entraîne la formation de structures secondaires,
  • Cette formation est principalement médiée par les liaisons hydrogène et l'empilement des bases des nucléotides.
  • Ainsi, des nucléotides diversement appariés et non appariés forment des éléments tels que les tiges, les boucles, les renflements, les jonctions et les pseudonœuds.

• Les éléments de structures secondaires s'assemblent à leur tour via des interactions entre boucles particulières ("kissing loop") ou via un empilement coaxial pour former des structures tertiaires des ARN telles que les triplets U°A-U ou les quadruplexes G (structures extrêmement stables formées par des séquences riches en guanine).

• Enfin, les interactions avec d'autres macromolécules (en particulier ARN-ARN, ARN-ADN et ARN-protéine) conduisent à la formation de structures quaternaires des ARN tels que les ribosomes ou les spliceosomes.

b. La liaison phosphodiester et la synthèse de la chaîne nucléotidique

Les chaînes d'ARN sont formées par la formation de liaisons phosphodiester entre les résidus de sucre successifs : les extrémités dites 5' et 3' de la chaîne sont libres : les chaînes d'ARN sont donc asymétriques (par exemple, 5'-ACGU-3 et 3'-ACGU-5' sont des molécules différentes).

L'extrémité 5' est considérée comme le début de la chaîne car c'est à cette extrémité que débute la synthèse de la chaîne nucléotidique :

• Lors de la synthèse d'un brin d'ADN (réplication de l'ADN) ou d'ARN (transcription), un nucléotide est ajouté à l'extrémité 3' du brin transcrit : le brin en cours de synthèse croît donc dans le sens 5' -> 3'.
• Le brin transcrit ou brin non codant ou brin matrice est le brin 3' -> 5'.

La polymérase lit le brin transcrit dans le sens 3' -> 5' : (i) le brin transcrit et le brin synthétisé sont complémentaires; (ii) le brin codant a la même séquence que l'ARNm (T versus U).

Voir un cours sur le métabolisme des bases puriques, des bases pyrimidiques et des nucléotides.

Acides nucléiques synthétiques ayant la même conformation que l'ADN et l'ARN

• acide nucléique à glycol : squelette composé d'unités glycol (au lieu du désoxyribose ou du ribose) liées par une liaison phosphodiester.
• acide nucléique peptidique : squelette composé d'unités N-(2-aminoéthyl)-glycine liées par une liaison peptidique, sans groupement phosphate.
• acide nucléique à thréose : squelette composé d'unités thréose liées par une liaison phosphodiester.

c. Modifications chimiques de l'ARN

L'ensemble des modifications de l'ARN s'appelle l'épitranscriptome lié au domaine en omique appelé épitranscriptomique.

• La première modification chimique de l'ARN a été découverte en 1951.
• Depuis, plus de 150 modifications chimiques distinctes ont été identifiées dans l'ARN codant et non codant.
• Des modifications dynamiques de l'ARN ont été identifiées dans le transcriptome, notamment : N6-méthyladénosine (m6A), inosine (I), 5-méthylcytosine (m5C), pseudouridine (Ψ), 5-hydroxyméthylcytosine (hm5C) et N1-méthyladénosine (m1A) :

Source : Song & Yi (2017)

Des modifications de plus grande ampleur ont lieu, par exemple : Q = queuosine; ManQ = mannosyl-queuosine; GalQ = galactosyl-queuosine.

Source : Valadon & Namy (2021)

MODOMICS : base de données des modifications d'ARN (structures chimiques des ribonucléosides modifiés, voies de biosynthèse, emplacement des résidus modifiés dans les séquences d'ARN et les enzymes de modification de l'ARN, ...).

d. Les bases modifiées des ARN de transfert (ARNt)

Les ARNt sont des petits ARN de 75 à 95 nucléotides qui jouent un rôle capital dans la traduction de l'ARN messager (synthèse de la chaîne polypeptidique).

La pseudouridine (Ψ) résulte d'une modification post-transcriptionnelle de l'uridine (isomérisation par rotation de 180° du cycle pyrimidine). C'est la modification la plus fréquente des bases des ARN et elle contribue à la stabilisation de la structure 3D des ARNt. La boucle TΨC comporte une pseudouridine.

La 5,6-dihydrouridine (boucle D) est non-plane. Elle perturbe les interactions d'empilement des bases dans les hélices et déstabilise la structure des ARN. Cette particularité est utilisée par certains organismes qui se développent à des températures trés basses et qui ont des ARNt riches en 5,6-dihydrouridine. Leurs ARNt restent ainsi localement flexibles à ces températures.

L'inosine contient une purine particulière : l'hypoxanthine. L'inosine peut former des appariements de type wobble ("appariement bancal") I-U, I-A et I-C. Ainsi, l'inosine est fréquemment en première position de l'anti-codon des ARNt, permettant au même ARNt de s'apparier à plusieurs codons synonymes. L'inosine résulte de la désamination de l'adénine par l'adénine désaminase (EC 3.5.4.2).

On trouve également : la 1-méthyladénosine, la 1-méthylguanosine, la 5-méthylcytidine, ... (voir la base de données The genomic tRNA database).

L'immunoprécipitation des ARN méthylés, suivie d'une technique de séquençage à haut débit ("Methylated RNA immunoprecipitation followed by sequencing" - MeRIP-Seq) permet d'obtenir le profil de la N6-méthyl-adénosine (m6A) à l'échelle du transcriptome.

e. Exemples de systèmes d'édition des bases des ARN

Système d'édition adénosine en inosine (A -> I) et cytidine en uridine (C -> U)

L'une des modifications post-transcriptionnelles de l'ARN les plus fréquentes est la conversion de l'adénosine en inosine (A -> I) catalysée par l'enzyme appelée adénosine désaminase agissant sur les ARN ("Adenosine Deaminase Acting on RNA" - ADAR).

La compréhension et la mise au point de systèmes CRISPR/Cas permet le développement systèmes programmables guidés par ARN :

• CIRTS ("CRISPR-Cas-Inspired RNA Targeting System" - Rauch et al., 2019)
• RESTORE ("Recruiting Endogenous ADAR to Specific Transcripts for Oligonucleotide-mediated RNA Editing" - Merkle et al., 2019)
• RESCUE ("RNA Editing for Specific C to U Exchange" - Abudayyeh et al., 2019)
• LEAPER ("Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing of RNA" - Qu et al., 2019)

Source : Aquino-Jarquin G. (2020)

Système d'édition uridine - cytidine (U -> C)

Il existe encore peu d'enzymes (issues de l'ingénièrie des protéines) pour l'édition uridine-cytidine (U -> C). Des données expérimentales et des analyses bioinformatiques des motifs des domaines protéiques indiquent que les protéines à domaines [DYW:KP] catalysent l'édition U -> C dans les mitochondries et les chloroplastes de certaines plantes.

Un système d'édition formé de 7 domaines [DYW:KP] fusionnés à 1 domaine PPR a ainsi été construit. Les protéines PPR ("PentatricoPeptide Repeat") sont des protéines de liaison à l'ARN localisées dans les mitochondries et/ou les chloroplastes et composées de motifs PPR (31 à 36 acides aminés) répétés en tandem.

Source : Gutmann et al. (2020)

La dénomination [DYW:KP] indique le dipeptide Lys-Pro conservé au début du domaine DYW. Les positions des motifs sont indiquées à gauche.

• Le site actif du domaine DYW contient un motif de fixation du zinc (CXXC) et le motif HXE où E est le résidu catalytique de la cytidine désaminase.
• La boîte PG semble capitale pour l'activité d'édition.

Voir un cours sur les domaines protéiques.

4. Les différents types d'ARN et leurs rôles

Les molécules d'ARN peuvent être classées en deux catégories : les ARN codants ("coding" - ARNc) et les ARN non codants ("non coding" - ARNnc).

Voir la bases de données GENCODE.

Source : Amin et al. (2019)

La figure ci-dessous illustre les rôles clés des ARN et des ribonucléotides dans les processus cellulaires. La voie de biosynthèse des ribonucléotides est très conservée.

• Comme les riboswitches, les longs ARNnc ("long ncRNA") et les petits ARNnc ("small ncRNA") jouent un rôle clé dans la régulation de la transcription des gènes.
• Les ribonucléotides sont réduits en désoxyribonucléotides par la ribonucléotide réductase (RNR) et certains de leurs dérivés, comme les coenzymes, participent à la catalyse et à l'activation ou l'inhibition des processus cellulaires dans des conditions de stress.

Source : Vazquez-Salazar & Lazcano (2018)

(1) L'ADN est transcrit par 3 ARN polymérases différentes en transcrits primaires ou précurseurs (Pre-RNA) des ARN ribosomiques (ARN polymérase I), des ARN messagers (ARN polymérase II) et des petits et grands ARN non codants (ARN polymérase III).

(2) Les ARN ribosomiques (ARNr - composants du ribosome) sont impliqués dans la traduction des ARN messagers. Le transcrit primaire de l'ARNr code pour 3 des quatre ARNr (5.8S, 18S et 28S). Il est synthétisé par l'ARN polymérase I et hydrolysé dans le nucléole à l'aide des petites RNP nucléolaires (snoRNPs / "small nucleolar RNA" - snoRNA).

L'ARNr (5S) est synthétisé par l'ARN polymérase III.

Source : Lieberman J. (2018) - Légende : 5' ETS et 3' ETS ("External Transcribed Spacer"). 5' ETS est un site d'hybridation des sno-ribonucléoprotéines U3; ITS ("Internal Transcribed Spacer") : ARN non fonctionnel entre les ARN ribosomiques structuraux; Gppp : guanosine triphosphate; UTR ("untranslated region") : région non traduite.

Les petits ARN non codants (snRNA) synthétisés par l'ARN polymérase III incluent :

• (3) Les snARN qui épissent les pré-ARN messagers au sein d'un complexe volumineux appelé le spliceosome.
• (4) Les petits ARN nucléolaires ("snoRNA") qui participent à la maturation des ARNr.
• (5) Les ARN de transfert ("tRNA") qui chargent les acides aminés sur la chaîne polypeptidique en cours de biosynthèse dans le ribosome.
• Les pré-microARN qui sont maturés en microARN (miRNA) dans le noyau. Les miRNA régulent le taux de la traduction en dégradant spécifiquement les ARN messagers ou en bloquant l'initiation de la traduction dans le cytosol : c'est l'interférence ARN.

Les "enhancer RNA" (eRNA) représentent une classe d'ARN non-codant relativement courts (50 - 2000 nucléotides) transcrits (ARN polymérase II) à partir des régions "enhancer" de l'ADN. Ils ont été détectés en 2010 (Kim et al., 2010) par les techniques RNAseq et ChIPseq. Les eRNA sont divisés en 2 classes (1D et 2D) qui diffèrent par leur taille, leur état de polyadénylation et la direction de leur transcription (dans un sens ou deux - transcription bidirectionnelle).

Voir un cours sur l'épigénétique.

5. L'ARN est un catalyseur

Dans les cellules "modernes", les enzymes catalysent la quasi totalité des réactions. La raison principale de cette spécialisation est que l'évolution a rendu ces macromolécules spécifiques sur le plan structural des molécules sur lesquelles elles agissent : leur subsrat.

De manière similaire, les molécules d'ARN, du fait de la nature chimique des ribonucléotides qui les composent, peuvent établir de nombreuses liaisons (de divers types) entre ces ribonucléotides et, par voie de conséquence, adopter de nombreuses structures. Les molécules d'ARN ont donc, comme les enzymes, une aptitude à se replier dans l'espace de sorte que des groupements chimiques interagissent : c'est le propre de la catalyse.

Les coenzymes ribonucléotidiques de nombreuses protéines actuelles (tableau ci-dessous) pourraient être des fossiles moléculaires issus d'un métabolisme basé sur l'ARN.

Le rôle de catalyseur de l'ARN est largement démontré :

• Des catalyseurs naturels de type ribozyme ont été découverts dans les années 1980 : exemples, les introns auto-épissables et le catalyseur ribonucléase P impliquée dans la maturation des ARN de transfert.
• L'ARN ribosomal catalyse la formation de liaisons peptidiques dans le ribosome.

Figure ci-dessous : organisation des domaines (numérotés de I à VI) d'un intron auto-catalytique de groupe II (ribozyme).

Source : R. Batey (2014)

• Une interaction à longue distance entre 3 paires de bases hautement conservées dans le domaine V et des nucléotides dans la région simple brin entre les domaines II et III font partie d'une structure appelée triplex catalytique qui est le cœur du site actif de l'ARN.
• L'interaction π - π' entre une boucle du domaine II et une section du domaine VI adjacente à l'adénosine du site de branchement ferait basculer l'intron entre les 2 étapes d'épissage.
• Le domaine IV porte souvent un gène ("Open Reading Frame" - ORF; pointillés) codant une protéine qui facilite la catalyse de l'épissage ou la mobilité de l'intron du groupe II. Il s'établit davantage d'appariements de paires de bases que ce qui est montré dans cette figure.

Mécanisme d'auto-clivage de l'ARN

Cette réaction de clivage d'un site spécifique (sans l'aide de protéines chaperones ou d'enzymes) s'effectue en général par le transfert d'un groupement phosphoester interne via une réaction chimique impliquant la catalyse acide / base générale et un ion métallique.

Source : Jimenez et al. (2015)

La catalyse acide-base générale implique une base générale qui déprotone le groupe 2'-hydroxyle du nucléophile, positionnée dans l'alignement du groupe 5'O partant.

La transestérification s'effectue via un intermédiaire état de transition phosphorane qui aboutit à un phosphate cyclique 2'-3' au niveau du nucléotide en amont et un oxyanion au niveau du nucléotide en aval. Le groupe partant est protoné par une base générale.

6. Les ribozymes

Hormis le ribosome qui catalyse la formation de la liaison peptidique, tous les ribozymes découverts jusqu'à présent dans la nature catalysent l'hydrolyse ou la ligation d'une liaison phosphodiester ou catalysent les deux réactions.

Thomas Cech et Sidney Altman ont obtenu le prix Nobel de chimie en 1989 pour leur découverte des propriétés catalytiques de l'ARN.

Jennifer Doudna, Thomas Cech et leurs collaborateurs ont déterminé la structure du ribozyme intron de groupe I de Tetrahymena thermophila (Cate et al., 1996). J. Doudna est à l'origine de la découverte de certaines propriétés du système CRISPR-Cas9.

Structure du ribozyme ARN satellite Varkud (mutant G638A) de Neurospora à une résolution de 3,1 Å

Code PDB : 4r4v

Ce ribozyme contient 7 segments hélicoïdaux séparés par des jonctions hélicoïdales à 3 voies.

b. Mécanisme catalytique des ribozymes auto-clivants

Source : Lee & Lee (2017)

• L'atome d'oxygène 2' nucléophile d'un ribose (nucléotide en position +1) attaque l'atome de phosphore adjacent suivi d'une protonation et du départ de l'oxygène en 5' d'un ribose du nucléotide en position -1.
• Le produit de la réaction en 5' est un groupe phosphate terminal 2',3'-cyclique et le produit de la réaction en 3' est un groupe hydroxyle 5'.
• La réaction de ligation semble une simple inversion de la réaction de clivage qui génère la liaison phosphodiester 3'-5'.

Les mécanismes de clivage de l'ARN par les ribozymes pourraient être décrits par une ou par une combinaison de quatre réactions moléculaires, qui contribuent à l'augmentation de la vitesse de catalyse :

• L'orientation en ligne dans le site actif de l'oxygène nucléophile en 2', du phosphore électrophile et de l'oxygène partant en 5'.
• La neutralisation de la charge négative de l'oxygène-phosphate non liant.
• La déprotonation du groupe hydroxyle en 2'.
• La neutralisation et la stabilisation de l'oxygène partant en 5'.

Ces caractéristiques structurales optimales pour la catalyse pourraient aussi expliquer en partie la réaction de transphosphorylation interne catalysée par une nucléase : la ribonucléase A. En particulier, l'orientation en ligne (catalyse dite α) avec un angle de torsion de 180° est essentielle pour une réaction de type S_N2.

Cependant, cette architecture n'est pas adoptée par une hélice d'ARN canonique : les ribozymes pourraient générer les interactions nécessaires à la stabilisation de cette conformation défavorable.

7. Les introns du groupe II (ribozyme)

a. Hypothèse d'un mécanisme évolutif commun au spliceosome et aux introns du groupe II

Les introns du groupe II sont des introns auto-catalytiques donc des ribozymes. Ils contiennent une structure en épingle à cheveux appelée domaine V (figure ci-dessous).

Les introns des groupes I et III sont également des ribozymes auto-épissables.

Figure a : élimination des introns (en rouge) et rattachement des régions des exons adjacents (en vert). Les réactions de transfert de phosphoryle lors de l'épissage (dont la première est indiquée par une flèche orange) sont catalysées par deux ions métalliques divalents (M1 et M2) qui établissent des liaisons de coordination (pointillés violets) avec :

• des atomes d'oxygène de groupes phosphate de nucléotides (astérisques) de cette région
• un atome d'oxygène non-pontant du site d'épissage
• un groupement OH d'une adénosine (A) de l'intron

Source : Strobel S.A. (2013)

Figure b : analogie avec le snRNA U6. Il a été montré que le snRNA de U6 (qui forme une structure en épingle à cheveux semblable à celle du domaine V) du spliceosome de la levure fournit un très grand nombre d'atomes d'oxygène de groupements phosphate spécifiques qui se lient aux deux ions métalliques catalytiques du site actif, de manière similaire à la coordination des ions métalliques des introns de groupe II (Fica et al., 2013).

Ces résultats :

• sont en faveur de l'hypothèse générale que l'épissage des pré-ARNm est fondamentalement une réaction catalysée par les ARN.
• indiquent aussi que les introns de groupe II et le spliceosome ont un mécanisme catalytique commun et probablement des origines communes en terme d'évolution.

Voir un cours sur le spliceosome.

b. Rôle du lariat dans l'épissage des introns de groupe II

Figure ci-dessous : structure (résolution 3.7 Å) de l'intron du groupe IIB P.li.LSUI2 de l'algue brune Pylaiella littoralis. Cet intron est sous sa forme lariat post-catalytique avec l'exon (produit) lié. C'est la première structure d'une molécule d'ARN 2′-5′.

Source : Robart et al. (2014)

Il existe 3 classes structurales d'introns du groupe II (IIA, IIB et IIC). Les introns du groupe II possèdent la séquence consensus GUGYG (avec Y = U ou C).

Les interactions tertiaires sont indiquées par des lettres grecques et les domaines par des chiffres romains.

• Le domaine V hautement conservé constitue le site actif de l'intron du groupe II. Il fixe des ions métalliques catalytiques contraignant.
• Le domaine VI contient l'adénosine "bombée" utilisée comme nucléophile lors de la première étape de l'épissage.

Les introns de groupe II (ribozymes) catalysent leur propre retrait de l'ARN et joignent les séquences exoniques flanquantes.

Source : Batey R. (2014)

Rappel des séquences consensus de pré-ARNm qui subissent un épissage : BPS : "branch point sequence" - 5'SS : "5' splicing site" - 3'SS : "3' splicing site".

1ère étape de l'épissage : le groupe hydroxyle d'une adénosine (A) du BPS de l'intron attaque la liaison phosphodiester du site 5'SS, ce qui forme :

• Un exon 5′ libre.
• Une structure dans laquelle l'extrémité 5′ de l'intron est liée à l'adénosine qui attaque via une liaison phosphodiester 2′ - 5′ nouvellement formée.

2ème étape : le groupe hydroxyle 3′ de l'exon 5′ attaque la liaison phosphodiester sur le site 3'SS, ce qui forme :

• Le produit de ligation, au sein duquel les exons sont réunis.
• La forme lariat de l'intron.

Voir un cours sur l'épissage et le spliceosome.

8. Les riboswitches

Les riboswitches sont des domaines d'ARN messagers qui se lient spécifiquement à un métabolite : cette fixation induit un changement de leur conformation. L'équilibre entre ces conformations (états lié et non lié) régulent divers processus liés à la transcription des gènes et / ou à la traduction des ARN messagers, sans l'intervention de protéines. C'est un mode de régulation rétro-actif ("feedback control") de la synthèse de certains métabolites (synthèse de certains acides aminés, des purines, ...).

• Processus régulés observés ou prédits : terminaison de la transcription, initiation de la traduction, contrôle de l'épissage chez les eucaryotes.
• Processus régulés observés ou prédits chez certaines bactéries : interférence de transcription ou action antisens, double transcription et contrôle de la traduction, action du ribozyme auto-clivant dépendant du ligand.

Les riboswitches ont pour l'instant été mis en évidence essentiellement chez les bactéries bien qu'il y ait des exemples chez certains archées, champignons et plantes. Ils ont été découverts en 2002 (Nahvi et al., Mironov et al.).

Les riboswitches sont la preuve que l'ARN fixe spécifiquement des métabolites, propriété d'ordinaire associée aux protéines ou aux ARN artificiels (les aptamères). Les riboswitches renforcent l'hypothèse du monde à ARN, en particulier, la nécessité que l'ARN originel ait été capable de fixer des petites molécules.

Voir un cours sur l'interférence ARN.

a. Les classes de riboswitches

Il existe une vingtaine de classes de riboswitches. Chacune d'elle est hautement spécifique d'un métabolite ligand. Par exemple, le riboswitch sensible à la guanine fixe ce métabolite avec une affinité 10⁵ fois supérieure à celle pour l'adénine, une différence considérable en regard de la similitude chimique et structurale de ces deux purines.

Cette sélectivité stricte est abolie par la substitution d'une seule base d'ARN dans le site de fixation du ligand. La reconnaissance extrême résulte d'une complémentarité structurale obtenue par encapsulation complète du ligand dans le riboswitch, ce qui crée des interactions spécifiques avec l'ARN.

La thiamine pyrophosphate (TPP) et la S-adénosylmethionine (SAM) sont plus complexes que les purines du point de vue chimique et structural. En particulier, TPP porte 2 groupes phosphate chargés négativement. Or, les molécules qui se fixent à l'ARN - chargé négativement - portent en général des groupes chargés positivement (interactions électrostatiques).

Les régions qui fixent TPP recrute des ions métalliques chargés positivement qui assurent la médiation de ces interactions électrostatiques. Tout comme la guanine ou l'adénine au sein des riboswitches sensibles aux purines, TPP et SAM sont alors profondément enfouis entre des hélices de l'ARN en interaction. Ce mode de reconnaissance du ligand, qui résulte de la flexibilité conformationnelle de l'ARN qui lui permet d'encapsuler le ligand, semble un mécanisme commun aux différentes classes de riboswitches.

b. Mécanisme

Les riboswitches sont donc des éléments génétiques cis-régulateurs que l'on trouve le plus souvent dans la région non traduite en 5' ("5'-UnTranslated Region" - 5'UTR) de l'ARN messager.

Source : Edwards et al. (2010)

Ces ARN se lient spécifiquement à de nombreux types de ligands : la liaison stabilise un certain état conformationnel ou provoque un changement conformationnel qui active ou désactive l'expression du gène en aval associé.

Les riboswitches sont composés de 2 domaines :

Source : Edwards et al. (2010)

• Le domaine aptamère fixe spécifiquement un ligand : cette fixation stabilise un état conformationnel ou provoque un changement de conformation qui active ou désactive la transcription du gène associé en aval. Les séquences et les structures des domaines aptamères sont hautement conservées.
• Le domaine plate-forme d'expression contrôle la transcription des gènes du fait de son aptitude à adopter 2 structures secondaires distinctes en réponse à la fixation du ligand.
  1. Lorsque le métabolite n'est pas lié (-M), la plate-forme d'expression (en bleu) incorpore la séquence de commutation (en violet) dans une [tige-boucle] anti-terminateur (AT) et la transcription s'effectue dans la région codante de l'ARN messager.
  2. Lorsque le métabolite se lie (+M), la séquence de commutation est incorporée dans le domaine aptamère (en rouge) et la plate-forme d'expression se replie dans un terminateur [tige-boucle] (T) interrompant la transcription.

9. Le dernier ancêtre commun universel (LUCA)

Le dernier ancêtre commun universel ("Last Universal Common Ancestor" - LUCA) est un intermédiaire évolutif supposé qui établirait un lien entre la phase abiotique de la Terre et l'apparition des premières traces de vie microbienne dans des roches de 3,8 à 3,5 milliards d'années, voire plus agées encore puisque des microorganismes fossilisés potentiels de 4,28 milliards d'années ont été isolés dans des roches sédimentaires de la ceinture de Nuvvuagittuq au Canada (Dodd et al., 2017).

LUCA n'est pas le premier organisme vivant apparu sur Terre : c'est l'ancêtre commun le plus récent de toutes les formes de vies actuelles.

La figure ci-dessous montre 3 scénarios du transfert (indiqué par les flèches) du mécanisme de réplication de l'ADN des virus aux cellules. Les lignées d'ARN sont en traits bleus et les lignées d'ADN en traits rouges, oranges ou bruns. Le cercle désigne LUCA.

Source : Forterre P. (2005)

• A. Un premier mécanisme a été transféré avant LUCA (flèche brune) puis a été remplacé par un second (flèche orange) chez les bactéries. Autre possibilité : ce remplacement aurait eu lieu dans une lignée commune aux archées et aux eucaryotes.
• B. Deux transferts indépendants de deux virus différents après LUCA.
• C. Trois transferts indépendants de virus différents après LUCA, chacun d'eux étant à l'origine d'un domaine cellulaire.

Caractéristiques supposées de LUCA

L'analyse de plus de 286.000 familles de gènes regroupant plus 6 millions de gènes (Weiss et al., 2016) a permis de mieux décrypter LUCA :

• LUCA disposait de systèmes complets de réplication et de transcription de l'ADN et possédait 30 à 100 protéines ribosomales pour la traduction.
• C'était probablement un organisme anaérobie et fixant l'azote.
• Il était sans doute thermophile comme l'indique la présence de l'enzyme gyrase inverse spécifique de ce type d'organisme.
• Une sous-unité (rotor-stator) de l'ATP synthase suggère qu'il était capable d'exploiter les gradients d'ions pour obtenir de l'énergie.
• Les enzymes de la voie énergétique sont celles de la voie de Harland Wood et Lars Ljungdahl : elle utilise H₂ comme donneur d'électrons et fixe le CO₂ comme accepteur d'électrons. H₂ était issu de sources géologiques car il ne pouvait pas être formé par la fermentation.
• Voir Ragsdale & Pierce (2008)

Apparition des règnes

• (A) L'arbre à 3 domaines est basé sur la phylogénie des ARN ribosomaux, ces 3 domaines étant de rang égal (Archaebacteria, Eubacteria et Eukaryota).
• (B) L'arbre à 2 domaines décrit les ribosomes du cytosol des eucaryotes comme une ramification de la diversité des ribosomes des archées : les eucaryotes constituent un groupe secondaire plus récent.
• (C) Cependant, les eucaryotes ne sont pas des archées "adultes" : en conséquence l'ancêtre des eucaryotes possédait des mitochondries. Si l'on tient compte des gènes dérivés des mitochondries, l'arbre ne contient plus de bifurcation.
• (D) Si on inclue les plastes, l'arbre ressemble encore moins à un arbre car les lignées photosynthétiques d'eucaryotes ont également acquis de nombreux gènes de l'ancêtre des plastides.

Source : Weiss et al. (2018)