Définir GFP.
Ecrire la formule développée du tripeptide cyclique chromophore SYG.
Quel est son rôle dans la GFP ?

La GFP ("Green Fluorescent Protein") naturelle est une protéine fluorescente verte découverte chez Aequorea victoria. Elle est dénommée avGFP (wtGFP).

C'est un monomère constitué de 238 acides aminés. Le chromophore est le centre réactionnel responsable de l’émission de fluorescence. Il est constitué d'un résidu sérine, d'un résidu déhydro-tyrosine et d'un résidu glycine (SYG).

Sous quelle forme est ce tripeptide pour être fonctionnel dans les protéines fluorescentes ?

• Le chromophore de la GFP est formé à partir du tripeptide cyclique [S₆₅-déhydroY₆₆-G₆₇], de manière autocatalytique (ni réaction enzymatique, ni cofacteur).
• La fluorescence verte émane de la forme anionique déprotonée du chromophore.
• Le fluorophore est très stable même à des températures élevées et à divers pH.

Visualisation de la GFP de Aequorea victoria à une résolution de 1,90 Å

Code PDB : 1EMA

La structure cristalline de la GFP a révélé que le chromophore tripeptide cyclique est enfoui au centre d'un "tonneau β" à onze brins entrelacés.

Au cours du repliement, le tripeptide est positionné au cœur du tonneau β : les réactions de cyclisation et de déshydratation nécessaires à la formation du chromophore mature ont alors lieu.

Quelles sont les longueurs d'onde d'excitation et d'émission maximales de la GFP non modifiée (avGFP) ?

• Le pic d'absorption (excitation) de avGFP est à λ = 395 nm.
• Le spectre d'émission de fluorescence de avGFP a un pic à λ = 509 nm.

Coefficient d'extinction molaire : ε_M ≈ 25000 M^-1.cm^-1 / Rendement quantique ≈ 0,79 / Luminosité ("brightness") relative ≈ 48%

• Les valeurs dépendent des sources. Celles mentionnées ci-dessus proviennent de FPbase.
• La luminosité théorique est calculée en multipliant ε_M par le rendement quantique.
• La luminosité est souvent normalisée par rapport à la valeur de luminosité de EGFP.

Comment obtient-on des protéines fluorescentes issues de la GFP ?
Quelles sont leurs caractéristiques de fluorescence ?

Diverses protéines fluorescentes sont obtenues par mutation de certains acides aminés de avGFP, notamment ceux qui constituent le chromophore.

• Les différents chromophores dérivent de la même structure : la p-hydroxybenzylidène-imidazolinone ou p-HBI (figure ci-dessous).
• La stabilisation de la forme phénol ou phénolate de Y₆₆ par des liaisons hydrogène explique l'obtention de variants GFP caractérisés par des spectres d'absorption et d'émission modifiés.
• Les protéines fluorescentes rouges ("Red Fluorescent Protein" - RFP) possèdent le même chromophore dérivé du tripeptide [H₆₅-déhydroY₆₆-G₆₇] (exemples : Kaede et EosFP, figure ci-dessous).

Chen et al. (2023) "Structural Characterization of Fluorescent Proteins Using Tunable Femtosecond Stimulated Raman Spectroscopy"
Int. J. Mol. Sci. 24, 11991

Avantages de la GFP et d’autres protéines fluorescentes (mutants) pour des études in vivo ?

• Observer la GFP est non invasif : on peut l'observer directement en éclairant l'échantillon avec de la lumière d'une certaine longueur d'onde.
• De plus, la GFP est une molécule relativement petite et inerte, qui ne semble interagir avec aucun processus biologique d'intérêt.
• La GFP étant un monomère, elle peut diffuser rapidement à travers les cellules.