MATÉRIELS

I. Matériel végétal utilisé pour la construction des banques d'ADNc

Les banques d’ADNc ont été construites à partir de 2 plantes légumineuses :

  • le pois (Pisum sativum)
  • une luzerne d’origine méditerranéenne (Medicago truncatula, modèle génétique des légumineuses)

à 2 temps d’imbibition différents significatifs de 2 stades physiologiques distincts pendant la phase de germination:

  • graines entières de Pisum sativum : 12h et 22h d’imbibition (graines entières) ;
  • axes embryonnaires de Medicago truncatula : 10h et 30h d’imbibition.

 

II. La souche bactérienne Escherichia coli LE 392

La souche E. coli LE 392 présente 2 avantages :

  • sa haute efficacité d’amplification des phages recombinants se caractérisant par un titre de banque élevé (voir les caractéristiques du phage l gt11);
  • la possibilité de criblage avec une sonde nucléotidique.

Contrairement à d’autres souches d’E. coli (par exemple Y1089), LE 392 exprime une b -galactosidase endogène et ne permet donc pas la sélection des clones recombinants avec le X-Gal par la coloration blanc -bleu. La culture de cette souche ne nécessite pas d’antibiotiques.

 

III. Le vecteur de clonage

a. Les différents types de phage l

Les bacteriophages ont été découverts en 1915 par Frederick Twort et indépendemment en 1917 par Félix D’Herelle. Le phage lambda fût, pour sa part, isolé d'une souche de E. coli lysogène pour ce phage en 1951 [Lederberg, E.M. (1951) "Lysogenicity in E. coli K12" Genetics 36, 560]. Il existe un très grand nombre de vecteurs de clonage dérivés du phage lambda, regroupés en "familles" :

  • Charon : 4A, 21A, 28, 32 à 35, 40 - Charomid : 9-20, 9-28 ;
  • gt : 10, 102, 11, 11D, 11SN, 18 à 23
  • EMBL : 3, 3A, 4, 12
  • l 2001, l ORF8, l ZAP, l DASH, l FIX ... et bien d'autres encore !

Il s’agit de mutants délétés de certains sites reconnaissables par des enzymes de restriction. Une partie de leur génome, non indispensable à la réplication et à la production de nouvelles générations de phages est éliminée. Ceci permet l’insertion d’ADNc d'une longueur allant jusqu’à 7,2 kpb.

L'utilisation du phage lambda est à l'origine d'un très grand nombre de découvertes en biologie moléculaire.

le phage l gt11

 

b. Incidence du clonage d'un ADNc dans le phage l gt10 sur les cycles de lysogénie et de lyse

Il existe 3 principaux groupes de bactériophages :

  • virulents : l'infection produit de nouveaux virus infectieux qui lysent la bactérie ;
  • filamenteux : l'infection produit de nouveaux virus infectieux qui ne lysent pas la bactérie ;
  • tempérés : il s'établit un équilibre entre phase de lysogènie et phase de lyse.

Le clonage d'un ADNc induit une transition entre ces deux phases.

 

IV. Autres matériels

Afin de travailler dans un environnement dépourvu de RNases, toute la vaisselle et toutes les solutions ont été traitées au DEPC 0,1% puis autoclavées (121°C, pendant 20 min)

  • voir des indications pour la préparation des solutions pour l'étude des ARN ;
  • le DEPC inhibe l’activité des RNases en se fixant de manière covalente à un résidu histidine du site actif.

Enfin, la construction de 4 banques en parallèle a été facilitée par l’utilisation de systèmes complets prêts à l’emploi (les "kits").