Le phage l gt11

(Young, R. A. & Davis, R. W. - 1983)

a. Caractéristiques générales

  • le phage l gt11 possède un ADN double brin encapsidé dans une tête icosahèdrale. Il possède une mutation "ambre" (sam100 ou S100) dans les gènes codant pour les protéines de la capside (gènes de la lyse). Ceci limite les risques de propagation de bactériophages recombinants dans des souches non transfectées conservées au laboratoire ;
  • il code aussi pour un répresseur sensible à la température (cIts857).

 

Par ailleurs certaines souches E. coli hôte possède un gène codant pour un suppresseur de mutation "ambre". C'est le cas de LE 392 qui possède le gène supF qui code pour un suppresseur ARNt qui introduit une tyrosine au niveau du codon UAG.

Cette souche est donc appropriée à la formation de plages de lyse abondantes (à une température où le répresseur est actif) et est utilisée pour la détermination du titre de la banque (voir la partie lysogénie & lyse).

 

source : Maria Schnos

University of Wisconsin - Madison

 

b. Caractéristiques pour le clonage et le criblage

  • le phage l gt11 - EcoRI est digéré par EcoRI, ce qui génère un site de clonage unique EcoRI près de l’extrémité C-terminale de la région codante du gène lacZ. Cette construction présente un inconvénient car le clonage d'ADNc est bidirectionnel : en effet, il y a 2 possibilités d’insertion du même ADNc (selon l'orientation 3’ ---> 5’ ou inversement). En conséquence, le nombre de clones recombinants différents dans la banque est divisé par 2 ;
  • le site de clonage EcoRI se situe 53 bp en amont du codon de terminaison de la b-galactosidase, ce qui permet la sélection des clones recombinants selon la coloration blanc - bleu après hydrolyse de X-Gal ;
  • l’expression de la protéine dont la séquence codante est clonée peut être induite par l’IPTG sous le contrôle du promoteur lac. La banque peut donc être criblée spécifiquement par l’utilisation d’anticorps. Elle peut l’être également par l’utilisation de sondes nucléotidiques marquées par un radioélément ;
  • le titre avec un ADN contrôle est > 1 x 107 pfu / g ADN du phage lambda et un bruit de fond (faux positifs) < 1.5 %.

 

c. Bibliographie

  • R. A. Young & R. W. Davis (1983a) "Efficient isolation of genes by using antibody probes" Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 1194 - 1198
  • R. A. Young & R. W. Davis (1983b) "Yeast RNA polymerase II genes : Isolation with antibody probes" Science 222, 778 -782