Enzymologie N°1 Vitesse initiale - Equation de Michaelis-Menten - Paramètres cinétiques : Vmax, KM, kcat |
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Question N°1 a. Tracé des cinétiques de la réaction enzymatique |
b. Détermination graphique des vitesses initiales à partir des cinétiques |
[S0] (mM) | vi (µmoles C.tube-1.min-1) |
10 | 0,34 |
20 | 0,56 |
30 | 0,75 |
100 | 1,28 |
150 | 1,42 |
c. Courbe de saturation issue des cinétiques |
VMax = 1,47 µmoles C.tube-1.min-1 | KM = 24 mM |
d. Représentation des doubles inverses ou représentation de Lineweaver-Burk |
1/VMax = 0,54 µmoles C-1.tube.min | -1/KM = - 0,022 mM-1 |
VMax = 1,85 µmoles C.tube-1.min-1 | KM = 45,5 mM |
e. Calcul de kcat Volume réactionnel = 2 mL substrat + 1 mL enzyme à une concentration de 3 µM => volume du tube = 3 mL = 3 10-3 L Donc : [E0] = 3 µM x (1 mL / 3 mL) = 1 10-6 moles.L-1 VMax = 1,85 µmoles C.tube-1.min-1 = 1,85 10-6 moles C . 3 10-3 L-1 . min-1 = 6,17 10-4 moles C.L-1.min-1 = 617 µM.min-1 VMax = kcat . [E0] => kcat = VMax / [E0] = 617 min-1 = 10,3 s-1 [l'acte catalytique a lieu 60 fois moins en 1 seconde qu'en 1 minute]. |
Question N°2 Dans les 2 cas, malgré les apparences, il s'agit de courbes de saturation (hyperbole) : vi = f([S]0). La gamme de concentrations de substrat étudiée (1 à 5 mM) n'est donc adaptée à aucune des 2 enzymes :
Par ailleurs : KME1 > KME2. En effet, pour [S]0 = 5 mM, E2 est saturée alors que l'on est au début de la courbe de saturation pour E1. Vue l'allure de ces 2 courbes de saturation, il est probable que VMaxE1 > VMaxE2. |
Question N°4 Courbe de saturation Les paramètres cinétiques sont déterminés à partir de la représentation de Lineweaver-Burk (figure ci-dessous). kcatIso = VmaxIso / [Iso]0 = 2,56 10-9 (M.s-1) / 10 10-12 (M) ===> kcatIso = 256 s-1 = 15360 min-1 Donc : kcatIso = kcatEinc et KMIso = KMEinc Par ailleurs : Vmax2ème expérience = Vmax(Iso + Einc) = 2 x Vmax1ère expérience Donc puisque Vmax double quand la concentration en enzyme double et que les autres paramètres ne sont pas modifiés, c'est que Einc est l'isomérase. |