Voir un cours sur les paramètres cinétiques des réactions enzymatiques.

Voir les énoncés.

Exercice N°1

a. Tracé des cinétiques de la réaction enzymatique

On reporte la variation de la concentration du produit C formé (en µmoles.tube^-1) en fonction du temps (en min).

b. Détermination graphique des vitesses initiales à partir des cinétiques

On obtient les valeurs suivantes :

c. Courbe de saturation issue des vitesses initiales déterminées à partir des cinétiques

A partir des valeurs du tableau ci-dessus, on trace la courbe de saturation v_i = f([S₀]) avec le même code couleur que les figures qui précèdent :

Cette courbe est une hyperbole qui répond à l'équation de Michaelis, Menten et Henri (hypothèse du quasi-équilibre) ou à l'équation de Briggs & Haldane (hypothèse de l'état stationnaire).

Les valeurs des paramètres cinétiques déterminées à partir de la courbe de saturation sont imprécises :

• La véritable vitesse maximale (V_max) correspond à l'asymptote de l'hyperbole (valeur infinie de concentration de substrat, impossible physiquement) : la valeur maximale de vitesse initiale réellement mesurée (point violet) est donc très sous-estimée.
• Comme K_M est la concentration en substrat [S₀] pour laquelle v_i = [valeur maximale de vitesse initiale/2], la valeur de K_M est également entachée d'erreur.

On obtient les valeurs suivantes :

d. Représentation des doubles inverses ou représentation de Lineweaver-Burk

On utilise d'autres représentations graphiques, en particulier celle dite des doubles inverses (même code couleur que les figures qui précèdent) :

A partir de cette droite, on obtient les valeurs suivantes :

Unités des inverses

En ce qui concerne les unités des inverses, c'est très simple : tout est inversé !
Exemples : mM devient mM^-1 ; µmole.min^-1 devient µmole^-1.min ; ΔA.s^-1 devient ΔA^-1.s

e. Calcul de k_cat

Volume réactionnel = 2 mL substrat + 1 mL enzyme à une concentration de 3 µM => volume du tube = 3 mL = 3 10^-3 L

Donc : [E₀] = 3 µM x (1 mL / 3 mL) = 1 10^-6 moles.L^-1

V_max = 1,85 µmoles C.tube^-1.min^-1 = 1,85 10^-6 moles C . 3 10^-3 L^-1 . min^-1 = 6,17 10^-4 moles C.L^-1.min^-1 # 617 µM.min^-1

V_max = k_cat . [E₀] => k_cat = V_max / [E₀] = 617 min^-1 = 10,3 s^-1

Attention : k_cat traduit le nombre de fois que l'acte catalytique a lieu par unité de temps (c'est une fréquence) => l'acte catalytique a lieu 60 fois moins en 1 seconde qu'en 1 minute.

Exercice N°3

Il s'agit d'un exercice qualitatif (sans calcul) qui s'appuie sur un raisonnement.

Dans les 2 cas, malgré les apparences, il s'agit de courbes de saturation (hyperbole) : vi = f([S]₀).

La gamme de concentrations de substrat étudiée (1 à 5 mM) n'est donc adaptée à aucune des 2 enzymes :

• Pour E1, les concentrations étudiées ne sont pas assez élevées : on ne détermine que les premiers points de la courbe de saturation.
• Pour E2, la gamme étudiée ne correspond qu'aux concentrations débouchant sur les v_i les plus élevées : il faut étudier des concentrations supplémentaires inférieures à 1 mM pour avoir la première partie de la courbe de saturation.

Par ailleurs : K_M^E1 > K_M^E2. En effet, pour [S]₀ = 5 mM, E2 est saturée alors que les valeurs de la courbe de saturation pour E1 sont plus faibles.

Vue l'allure de ces 2 courbes de saturation, il est probable que V_max^E1 > V_max^E2.

Voir un exercice équivalent en présence d'un inhibiteur.

Exercice N°4

Les paramètres cinétiques sont déterminés à partir de la représentation de Lineweaver-Burk (figure de droite ci-dessous).

k_cat^Isomérase = V_max^Isomérase / [Isomérase]₀ = 2,56 10^-9 (M.s^-1) / 10 10^-12 (M) => k_cat^Isomérase = 256 s^-1 = 15360 min^-1

Donc : k_cat^Isomérase= k_cat^{E inconnue} et K_M^Isomérase= K_M^{E inconnue}

Par ailleurs : V_max^{2ème expérience} = V_max^{(Isomérase + E inconnue)} = 2 x V_max^{1ère expérience}

Puisque V_max double quand la concentration en enzyme double et que les autres paramètres ne sont pas modifiés, E_inc est l'isomérase.