Question N°1

a. Tracé des cinétiques de la réaction enzymatique

b. Détermination graphique des vitesses initiales à partir des cinétiques

c. Courbe de saturation issue des cinétiques

d. Représentation des doubles inverses ou représentation de Lineweaver-Burk

e. Calcul de k_cat

Volume réactionnel = 2 mL substrat + 1 mL enzyme à une concentration de 3 µM => volume du tube = 3 mL = 3 10^-3 L

Donc : [E₀] = 3 µM x (1 mL / 3 mL) = 1 10^-6 moles.L^-1

V_Max = 1,85 µmoles C.tube^-1.min^-1 = 1,85 10^-6 moles C . 3 10^-3 L^-1 . min^-1 = 6,17 10^-4 moles C.L^-1.min^-1 = 617 µM.min^-1

V_Max = k_cat . [E₀] => k_cat = V_Max / [E₀] = 617 min^-1 = 10,3 s^-1

[l'acte catalytique a lieu 60 fois moins en 1 seconde qu'en 1 minute].

Question N°2

Dans les 2 cas, malgré les apparences, il s'agit de courbes de saturation (hyperbole) : vi = f([S]₀).

La gamme de concentrations de substrat étudiée (1 à 5 mM) n'est donc adaptée à aucune des 2 enzymes :

• pour E1, la gamme n'est pas assez grande : on ne détermine que les premiers points de la courbe de saturation.
• pour E2, la gamme étudiée ne correspond qu'aux v_i les plus élevées : il faut étudier des concentrations supplémentaires inférieures à 1 mM pour avoir le début de la courbe de saturation.

Par ailleurs : K_M^E1 > K_M^E2. En effet, pour [S]₀ = 5 mM, E2 est saturée alors que l'on est au début de la courbe de saturation pour E1.

Vue l'allure de ces 2 courbes de saturation, il est probable que V_Max^E1 > V_Max^E2.

Question N°4

Courbe de saturation

Les paramètres cinétiques sont déterminés à partir de la représentation de Lineweaver-Burk (figure ci-dessous).

k_cat^Iso = V_max^Iso / [Iso]₀ = 2,56 10^-9 (M.s^-1) / 10 10^-12 (M) ===> k_cat^Iso = 256 s^-1 = 15360 min^-1

Donc : k_cat^Iso = k_cat^Einc et K_M^Iso = K_M^Einc

Par ailleurs : V_max^{2ème expérience} = V_max^{(Iso + Einc)} = 2 x V_max^{1ère expérience}

Donc puisque V_max double quand la concentration en enzyme double et que les autres paramètres ne sont pas modifiés, c'est que E_inc est l'isomérase.