Enzymologie N°1

Vitesse initiale - Equation de Michaelis-Menten - Paramètres cinétiques : Vmax, KM, kcat

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Voir un cours sur les paramètres cinétiques des réactions enzymatiques.

Question N°1

a. Tracé des cinétiques de la réaction enzymatique

enzymologie Enzymology enzymologie parametre cinetique kinetics parameter kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme turnover Michaelis Menten Henri biochimej

b. Détermination graphique des vitesses initiales à partir des cinétiques

enzymologie Enzymology enzymologie parametre cinetique kinetics parameter kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme turnover Michaelis Menten Henri biochimej

[S0] (mM) vi (µmoles C.tube-1.min-1)
10 0,34
20 0,56
30 0,75
100 1,28
150 1,42

c. Courbe de saturation issue des cinétiques

enzymologie Enzymology kinetics parameter kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme courbe saturation biochimej

VMax = 1,47 µmoles C.tube-1.min-1 KM = 24 mM

d. Représentation des doubles inverses ou représentation de Lineweaver-Burk

enzymologie Enzymology kinetics parameter kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme Lineweaver Burk biochimej

1/VMax = 0,54 µmoles C-1.tube.min -1/KM = - 0,022 mM-1
VMax = 1,85 µmoles C.tube-1.min-1

KM = 45,5 mM

e. Calcul de kcat

Volume réactionnel = 2 mL substrat + 1 mL enzyme à une concentration de 3 µM => volume du tube = 3 mL = 3 10-3 L

Donc : [E0] = 3 µM x (1 mL / 3 mL) = 1 10-6 moles.L-1

VMax = 1,85 µmoles C.tube-1.min-1 = 1,85 10-6 moles C . 3 10-3 L-1 . min-1 = 6,17 10-4 moles C.L-1.min-1 = 617 µM.min-1

VMax = kcat . [E0] => kcat = VMax / [E0] = 617 min-1 = 10,3 s-1

[l'acte catalytique a lieu 60 fois moins en 1 seconde qu'en 1 minute].

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Question N°2

enzymologie Enzymology kinetics parameter kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme biochimej

Dans les 2 cas, malgré les apparences, il s'agit de courbes de saturation (hyperbole) : vi = f([S]0).

La gamme de concentrations de substrat étudiée (1 à 5 mM) n'est donc adaptée à aucune des 2 enzymes :

  • pour E1, la gamme n'est pas assez grande : on ne détermine que les premiers points de la courbe de saturation.
  • pour E2, la gamme étudiée ne correspond qu'aux vi les plus élevées : il faut étudier des concentrations supplémentaires inférieures à 1 mM pour avoir le début de la courbe de saturation.

Par ailleurs : KME1 > KME2. En effet, pour [S]0 = 5 mM, E2 est saturée alors que l'on est au début de la courbe de saturation pour E1.

Vue l'allure de ces 2 courbes de saturation, il est probable que VMaxE1 > VMaxE2.

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Question N°4

Courbe de saturation

enzymologie Enzymology kinetics parameter kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme biochimej

Les paramètres cinétiques sont déterminés à partir de la représentation de Lineweaver-Burk (figure ci-dessous).

enzymologie Enzymology kinetics parameter kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme biochimej

kcatIso = VmaxIso / [Iso]0 = 2,56 10-9 (M.s-1) / 10 10-12 (M) ===> kcatIso = 256 s-1 = 15360 min-1

Donc : kcatIso = kcatEinc et KMIso = KMEinc

Par ailleurs : Vmax2ème expérience = Vmax(Iso + Einc) = 2 x Vmax1ère expérience

Donc puisque Vmax double quand la concentration en enzyme double et que les autres paramètres ne sont pas modifiés, c'est que Einc est l'isomérase.

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