Enzymologie N°1

Vitesse initiale - Equation de Michaelis-Menten - Paramètres cinétiques : Vmax, KM, kcat

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Voir un cours sur les paramètres cinétiques des réactions enzymatiques.

Exercice N°1

a. Tracé des cinétiques de la réaction enzymatique

On reporte la variation de la concentration du produit C formé (en µmoles.tube-1) en fonction du temps (en min).

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b. Détermination graphique des vitesses initiales à partir des cinétiques

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Calcul de la pente de la tangente à l'origine de chaque cinétique : y2 - y1
------
x2 - x1
[C]2 - [C]1
---------------
temps2 - temps1

On obtient les valeurs suivantes :

[S0] (mM) vi (µmoles C.tube-1.min-1)
10 0,34
20 0,56
30 0,75
100 1,28
150 1,42

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c. Courbe de saturation issue des vitesses initiales déterminées à partir des cinétiques

A partir des valeurs du tableau ci-dessus, on trace la courbe de saturation vi = f([S0]) avec le même code couleur que les figures qui précèdent :

Enzymology enzymologie parametre cinetique kinetics parameter vitesse maximale kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme turnover Michaelis Menten Henri Lineweaver Burk biochimej

Cette courbe est une hyperbole qui répond à l'équation de Michaelis, Menten et Henri (hypothèse du quasi-équilibre) ou à l'équation de Briggs & Haldane (hypothèse de l'état stationnaire).

Les valeurs des paramètres cinétiques déterminées à partir de la courbe de saturation sont imprécises :

  • La véritable vitesse maximale (Vmax) correspond à l'asymptote de l'hyperbole (valeur infinie de concentration de substrat, impossible physiquement) : la valeur maximale de vitesse initiale réellement mesurée (point violet) est donc très sous-estimée.
  • Comme KM est la concentration en substrat [S0] pour laquelle vi = [valeur maximale de vitesse initiale/2], la valeur de KM est également entachée d'erreur.

On obtient les valeurs suivantes :

Vmax = 1,47 µmoles C.tube-1.min-1 KM = 24 mM

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d. Représentation des doubles inverses ou représentation de Lineweaver-Burk

On utilise d'autres représentations graphiques, en particulier celle dite des doubles inverses (même code couleur que les figures qui précèdent) :

enzymologie Enzymology kinetics parameter kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme Lineweaver Burk biochimej

A partir de cette droite, on obtient les valeurs suivantes :

1/Vmax = 0,54 µmoles C-1.tube.min => Vmax # 1,85 µmoles C.tube-1.min-1

-1/KM = - 0,022 mM-1 => KM = 45,5 mM

Unités des inverses

En ce qui concerne les unités des inverses, c'est très simple : tout est inversé !
Exemples : mM devient mM-1 ; µmole.min-1 devient µmole-1.min ; ΔA.s-1 devient ΔA-1.s

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e. Calcul de kcat

Volume réactionnel = 2 mL substrat + 1 mL enzyme à une concentration de 3 µM => volume du tube = 3 mL = 3 10-3 L

Donc : [E0] = 3 µM x (1 mL / 3 mL) = 1 10-6 moles.L-1

Vmax = 1,85 µmoles C.tube-1.min-1 = 1,85 10-6 moles C . 3 10-3 L-1 . min-1 = 6,17 10-4 moles C.L-1.min-1 # 617 µM.min-1

Vmax = kcat . [E0] => kcat = Vmax / [E0] = 617 min-1 = 10,3 s-1

Attention : kcat traduit le nombre de fois que l'acte catalytique a lieu par unité de temps (c'est une fréquence) => l'acte catalytique a lieu 60 fois moins en 1 seconde qu'en 1 minute.

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Exercice N°3

enzymologie Enzymology kinetics parameter kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme biochimej

Il s'agit d'un exercice qualitatif (sans calcul) qui s'appuie sur un raisonnement.

Dans les 2 cas, malgré les apparences, il s'agit de courbes de saturation (hyperbole) : vi = f([S]0).

La gamme de concentrations de substrat étudiée (1 à 5 mM) n'est donc adaptée à aucune des 2 enzymes :

  • Pour E1, les concentrations étudiées ne sont pas assez élevées : on ne détermine que les premiers points de la courbe de saturation.
  • Pour E2, la gamme étudiée ne correspond qu'aux concentrations débouchant sur les vi les plus élevées : il faut étudier des concentrations supplémentaires inférieures à 1 mM pour avoir la première partie de la courbe de saturation.

Par ailleurs : KME1 > KME2. En effet, pour [S]0 = 5 mM, E2 est saturée alors que les valeurs de la courbe de saturation pour E1 sont plus faibles.

Vue l'allure de ces 2 courbes de saturation, il est probable que VmaxE1 > VmaxE2.

Voir un exercice équivalent en présence d'un inhibiteur.

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Exercice N°4

Les paramètres cinétiques sont déterminés à partir de la représentation de Lineweaver-Burk (figure de droite ci-dessous).

enzymologie Enzymology kinetics parameter kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme biochimej

1ère expérience
[Isomérase] = 10 pM
1/Vmax = 0,39 nM-1.s => VMax = 2,56 nM.s-1

-1/KM = - 4,35 µM-1

=> KM = 0,23 µM

2ème expérience
[Isomérase] = 10 pM + [E inconnue] = 10 pM
1/Vmax = 0,20 nM-1.s => VMax = 5 nM.s-1

kcatIsomérase = VmaxIsomérase / [Isomérase]0 = 2,56 10-9 (M.s-1) / 10 10-12 (M) => kcatIsomérase = 256 s-1 = 15360 min-1

Donc : kcatIsomérase= kcatE inconnue et KMIsomérase= KME inconnue

Par ailleurs : Vmax2ème expérience = Vmax(Isomérase + E inconnue) = 2 x Vmax1ère expérience

Puisque Vmax double quand la concentration en enzyme double et que les autres paramètres ne sont pas modifiés, Einc est l'isomérase.

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