1. Développement de capteurs électrochimiques

a. Electrode à pâte de carbone
b. Electrode à fibre de carbone

2. Mise au point d'une biopile à champignon

3. Application de la biopile : étude du diclofenac

4. Enzymes de dégradation de dérivés ligno-cellulosiques

a. Les peroxydases - oxydation extracellulaire
b. Autres enzymes
c. Electrode à laccase

5. La bioremédiation

6. Liens Internet et références bibliographiques

1. Développement de capteurs électrochimiques

a. Electrode à pâte de carbone

Des travaux récents démontrent le potentiel d'utilisation d'une électrode en pâte de carbone modifiée chimiquement par des parches de café ("coffee husks" - enveloppe interne située sous le péricarpe du fruit du caféier) pour déterminer la concentration de l'acétaminophène par une méthode électrochimique.

Figure ci-dessous : courbes obtenues par voltammètrie ("Square Wave Voltammetry") pour des concentrations croissantes d'acétaminophène (1 à 75 mg.L^-1 - enregistrements A à L). Cette étude a permis de déterminer la concentration du paracétamol (acétaminophène) dans des cachets de doliprane 1000 du commerce.

Source : Mbokou et al. (2016a)

Figure en insert : courbe d'étalonnage du capteur électrochimique qui met en évidence une plage de réponse linéaire allant de 6,6 μM à 0,5 mM avec une sensibilité de 0,63 μA.mg^-1.L et une limite de détection de 0,66 μM.

b. Electrode à fibre de carbone

La mise au point d'une électrode à fibre de carbone montre qu'elle est plus performante (Mbokou et al., 2016b).

Cliché ci-dessus : une ultramicroélectrode constituée d'une seule fibre de carbone (M. Pontié (2016).

Figure ci-dessous : voltammètrie cyclique (vitesse de balayage : 10 mV.s^-1) de (a) hydroquinone / (b) acide salicylique / (c) paracétamol.

Source : Sys et al. (2017)

Les composés sont à une concentration de 0,5 mM dans un tampon acétate 0,01 mM à pH 5. Lignes pointillées : électrode à pâte de carbone nue / traits pleins : électrode en pâte de carbone modifiée avec la laccase.

Article : Elgrishi et al. (2018) "A practical beginner's guide to cyclic voltammetry" J. Chem. Educ. 95, 197 - 206

2. Mise au point d'une biopile à champignon

Les biopiles proposent une solution de production durable (décarbonée) d'énergie électrique associée à une dépollution des eaux et autres milieux.

Voir le document : "Défis technologiques des biopiles à champignon".

Voir le document : "Comment ça marche ?".

Cette technologie, basées sur la catalyse de réactions électrochimiques par des biofilms bactériens à la surface d'électrodes, présente l'inconvénient de former des sous-produits de dégradation cancérogènes, mutagènes et reprotoxiques (CMR) lors du traitement d'eaux chargées en résidus médicamenteux aromatiques.

La biopile fongique (M. Pontié et al.) produit de l'électricité tout en éliminant les résidus médicamenteux présents dans les eaux usées.

Source : M. Pontié (2016)

Source : M. Pontié (2017)

Clichés ci-dessus : à gauche, feutre de carbone (anode de la biopile) recouvert d'un biofilm de champignon; à droite, anode colonisée vue au microscope électronique à balayage.

3. Application de la biopile : étude du diclofenac

• Diclofenac (C₁₄H₁₁Cl₂NO₂, appelée aussi Voltaren) : cette molécule appartient à la classe des composés organiques dichlorobenzènes
• Groupe fonctionnel acide monocarboxylique = acide phényl-acétique avec un groupe (2,6-dichlorophényl)-amino en position 2
• Solubilité dans l'eau = 0,0045 g/L
• Voir les informations détaillées - PubChem.
• Voir les informations détaillées ChEBI.

La bioremédiation par le champignon de la pourriture blanche Trametes versicolor forme divers intermédiaires plus ou moins toxiques (Marco-Urrea et al., 2010).

Rôles biologiques :

• médicament analgésique non narcotique qui ne se lie pas aux récepteurs opioïdes.
• antipyrétique et anti-inflammatoire non stéroïdien qui se fixe aux cyclo-oxygénases (EC 1.14.99.1).
• inhibiteur de la prostaglandine - endoperoxyde synthase (E.C. 1.14.99.1) : il empêche la fixation l'acide arachidonique (substrat) et, par voie de conséquence, la formation d'icosanoïdes, de prostaglandines et de thromboxanes.

Métabolisme du diclofénac chez l'homme :

• glucuronidation de l'acyle catalysée par l'uridine 5'-diphosphoglucuronosyl transférase 2B7 (acide diclofénac β-D-glucosiduronique)
• hydroxylation du phényle en 4'-hydroxydiclofénac catalysée par le cytochrome P450 CYP2C9 et CYP3A4 (3'-hydroxydiclofénac, 4'-hydroxydiclofénac et 5'-hydroxydiclofénac
• Autres métabolites : 3'-hydroxy-4'-methoxydiclofenac, 4',5-dihydroxydiclofenac, 4'-hydroxydiclofénac quinone imine et 5-hydroxydiclofénac quinone imine, aceclofénac

Article : Pontié et al. (2018) "Enhanced direct oxidation of diclofenac (DCF) at a carbon paste electrode (CPE) modified with cellulose and its biodegradability by Scedosporium dehoogii" Res. Rev. Electrochem. 9, 114 - 128

Visualisation du cytochrome P450 105D7 de Streptomyces avermitilis complexé au diclofenac (DIF) à une résolution de 2,2 Å

Code PDB : 4UBS - Xu et al. (2015)

Remarques :

• Résidus 10 à 402
• EC 1.14.14.11
• Uniprot : Q93H05
• K_D^diclofenac = 65 μM

4. Enzymes de dégradation de dérivés ligno-cellulosiques

Voir le document : "Séparer les principaux constituants des végétaux".

a. Les peroxydases - oxydation extracellulaire

Les principales peroxydases à haut potentiel rédox de champignons dites de classe II, sont impliquées dans la biodégradation de la ligno-cellulose avec une gamme exceptionnelle de substrats organiques et inorganiques.

Les peroxydases sont des enzymes contenant un seul hème (protoporphyrine IX), de sorte que le spectre d'absorption de ces enzymes a un maximum d'absorbance particulier à 406-409 nm. Les peroxydases sont divisées en plusieurs types.

Les peroxydases des lignines (ligninase, LiP - E.C. 1.11.1.14)

La valeur du potentiel rédox du groupement hème (atome de fer - E₀' = +1,2 V à +1,5 V) permet que le site catalytique de ces enzymes oxyde une grande variété de substrats phénoliques et non phénoliques en présence de H₂O₂.

• 1-(3,4-diméthoxyphenyl)-2-(2-méthoxyphenoxy)propane-1,3-diol + H₂O₂ <=> 3,4-diméthoxybenzaldéhyde + 2-méthoxyphenol + glycolaldehyde + H₂O

• Dépolymérisation des lignines : catalyse le clivage Cα-Cβ des chaînes latérales propyle des lignines. L'alcool de vératryle semble nécessaire pour activer l'enzyme, notamment pour oxyder les lignines.

Il existe une très grande diversité / hétérogénéïté de lignines. Elles constituent la source de carbone organique la plus importante sur terre et représentent près de 30% du carbone séquestré chaque année dans les matières végétales. Des fragments de type lignine étaient présents il y a environ 430 millions d'années. Ce sont des polymères non linéaires complexes, dont le précurseur est la phénylalanine.

La proportion de chacun des 3 monomères constitutifs des lignines permet de les classer : lignines d'herbacées, de résineux et de feuillus.

Les peroxidases à manganèse (MnP - E.C .1.11.1.13)

• Valeur du potentiel rédox : E₀' = +1,0 V à +1,2 V
• Elles catalysent l'oxydation de Mn²⁺ en Mn³⁺ : 2 Mn²⁺ + 2 H⁺ + H₂O₂ <=> 2 Mn³⁺ + 2 H₂O
• Mn³⁺ agit comme un composé rédox diffusible et il oxyde une variété de composés de lignines.
• Un acide gras insaturé tel que le linoléate pourrait être un médiateur de la MnP.

Autres types de peroxydases

Les peroxydases décolorantes de pigments ("dye-decolorizing peroxidases" - DyP - E.C. 1.11.1.19 - Basidiomycètes) :

• Valeur du potentiel rédox : E₀' = +1,2 V à +1,5 V
• Elles catalysent des réactions dépendantes de H₂O₂
• Enzymes bifonctionnelles ayant des activités oxydantes et hydrolytiques sur les composés organiques phénoliques et non phénoliques, dont certains (par exemple certains colorants textiles récalcitrants et le p-nitrophénol) sont mal acceptés par d'autres peroxydases.

Les chloroperoxydases halogénantes (E.C. 1.11.1.10 - Ascomycètes) et les peroxygénases non spécifiques ou aromatiques (E.C. 1.11.2.1) :

• Superfamille des hème-thiolate peroxydases (ou haloperoxydases - Ascomycètes et Basidiomycètes).
• Elles transfèrent l'oxygène peroxyde aux substrats.
• Elles sont capables d'agir sur une gamme particulièrement larges de substrats sur lesquels elles effectuent des réactions telles que : la peroxygénation aromatique, l'époxydation double liaison, l'hydroxylation des composés aliphatiques, le clivage de groupement éther, la sulfoxydation, la N-oxydation et l'oxydation du bromure.

b. Autres enzymes

Les enzymes qui décomposent la cellulose, l'hémicellulose et la lignine sont généralement appelées cellulases, hémicellulases et enzymes de modification de la lignine ("lignin-modifying enzymes"). Ces enzymes sont classées en plusieurs familles et sous-familles dans la base de données CAZy.

La base de données CAZy ("Carbohydrate-Active enZYmes Database") décrit les familles de domaines fonctionnels (domaines catalytiques et de fixation aux glucides) des enzymes qui dégradent, modifient ou créent des liaisons glycosidiques.

c. Electrode à laccase

Les laccases (E.C. 1.10.3.2) sont des oxydoréductases à cuivre (4 atomes de cuivre par enzyme) trouvées dans de nombreuses plantes, champignons et micro-organismes. Ces enzymes ont une masse molaire ≥ 60 kDa (supérieures à celles des peroxydases) et un point isoélectrique acide. Les laccases sont glycosylées.

Les laccases catalysent l'oxydation directe de divers phénols, des polyphénols et des anilines, très présents chez les végétaux supérieurs, les champignons et les bactéries.

Des électrodes ont été modifiées avec des dérivés d'aryldiazonium possédant des groupements hydrophobes (anthraquinone, anthracène, naphtalène, chrysène) dans le but de greffer et de connecter la laccase.

La capacité de l'anthraquinone à immobiliser et à orienter la laccase a été optimisée avec un dérivé de bis-anthraquinone-pyrène dont la géométrie n'autorise qu'un empilement π partiel sur les nanotubes de carbone facilitant ainsi la liaison à la laccase. L'utilisation d'électrodes à base de nanotubes de carbone permet d'obtenir des courants catalytiques élevés supérieurs à 1 mA.cm^-2.

Une autre stratégie consiste à fonctionnaliser les nanotubes de carbone par polymérisation électrochimique de films organiques. Un film poly(pyrrole - pyrène) électrogénéré permet l'immobilisation covalente de la laccase via son interaction avec le pyrène polymérisé, ce qui donne une biocathode à haute performance avec une densité de courant catalytique de 1,85 mA.cm^-2 à 0,3 V (vs. l'électrode au calomel saturée) en solution saturée en oxygène. Ces électrodes sont très stables en décharge continue.

Figure ci-dessous : immobilisation orientée de la laccase par des interactions supramoléculaires entre la poche hydrophobe de l'enzyme et des hydrocarbures polyaromatiques (anthraquinone, anthracène, nathpthalène ou pyrène) fixés à des électrodes à base de carbone.

Source : Cosnier et al. (2014)