a. Culture de E. coli LE392

La souche bactérienne a été cultivée soit :

• Dans du milieu liquide LB (bactotryptone 10 g/l ; extrait de levure 5 g/l ; NaCl 5 g/l) supplémenté en MgSO₄ 10 mM et en maltose 0,2 %.
• Sur milieu solide (milieu LB avec 15 g/l d'agar).

Ces milieux de culture ont été stérilisés par autoclavage (121°C pendant 20 min).

• Une pré-culture de nuit à 37°C a été effectuée en ensemençant 1,5 mL de LB supplémenté avec une colonie isolée de E. coli LE 392 fraîchement étalée.
• Puis 50 ml de LB supplémenté ont été ensemencés avec 500 µL de la pré-culture.
• Les bactéries ont été cultivées à 37°C jusqu'à une valeur de densité optique à 600 nm de 0,6 - 0,8 (phase exponentielle de croissance).

b. Transfection de E. coli LE392

Chaque milieu d'empaquetage a été dilué au 1/100, au 1/1 000 et au 1/10 000 dans du tampon de phage (les témoins ont été dilués au 1/10 000).

Les bactéries sont ensuite transfectées par les phages en mélangeant 100 µL de milieu d'empaquetage dilué à 100 µL de culture bactérienne. Le mélange est incubé à 37°C et le temps d'adsorption des phages varie de 30 min à 1 heure.

• Le maltose induit l'expression de la protéine Lam B qui est un transporteur du maltose (maltoporine) ancré dans la membrane externe de la bactérie et sur laquelle s'adsorbe spécifiquement le phage .
• Le magnésium, quant à lui, est essentiel pour la stabilité du phage λ.

Schéma modifié de Applied Molecular genetics

Voir une photographie de l'adsorption du phage λ sur E. coli :

Les 200µl de milieu d'adsorption ont été ajoutés à 3ml de TB ("Terrific Broth") top agar (bactotryptone 10 g/l ; NaCl 5 g/l ; agar 8 g/l ; MgSO₄ 10 mM) préalablement chauffé à 46°C (pour maintenir ce milieu à l'état liquide) puis le tout est étalé sur du milieu LB solide (préchauffé à 37°C).

d. Lyse des bactéries et détermination du titre

Après une nuit à 37°C, les plages de lyse apparaissent sous la forme de petites zones circulaires translucides. Le titre de la banque est calculé en ramenant le nombre de plages de lyse à la dilution du milieu d'empaquetage et à 1 mL de culture bactérienne.

Voir la phase de lysogénie et la phase lytique du phage λ :