Amplification PCR ADNc Construction banque ADNc graine Pisum sativum Medicago truncatula germination biochimej

Construction de banques d'ADNc de semences de Pisum sativum et de Medicago truncatula

Purification des ARNm et synthèse des ADNc

La quantité des ARN messagers est bien souvent trop faible pour pouvoir contrôler l'étape de purification.

La purification des ARN messagers et leur rétro-transcription ont donc été indirectement contrôlées en amplifiant les ADNc avec différents couples d'amorces (voir les séquences) :

EF1a : facteur de transcription
GS1a : isoforme 1 cytosolique de la glutamine synthétase de Medicago truncatula
GS : isoforme cytosolique de la glutamine synthétase de Pisum sativum
GDH : ensemble d'oligonucléotides dégénérés issus de l'alignement de séquences de glutamate déshydrogénase (EC 1.4.1.2 et 1.4.1.3). La taille du produit d'amplification est 420 pb.

Les produits d'amplification ont été déposés sur gel d'électrophorèse (agarose 1 %) :

glutamate dehydrogenase vecteur clonage phage lambda gt11 extraction purification ARN totaux synthese premier second brin ADNc insert encapsidation recombinant transfection coli LE392 criblage titre banque sonde radioactive biochimej

Medicago truncatula : A : marqueurs de taille; B : 10 h - EF1α; C : 30 h - EF1α; D : 10 h - GS1a; E : 30 h - GS1a
Pisum sativum : F : marqueurs de taille ; G : 12 h - GS; H : 12 h - EF1α; I : 22 h - GS; J : 22 h - EF1α

A : marqueurs de taille
Pisum sativum : B : 12 h - GDH; C : 22 h - GDH
Medicago truncatula : D : 10 h - GDH; E : 30 h - GDH

Conclusions

Seules 2 amplifications n'ont pas donné de produit (MT 30 h avec EF1a et GS1a).
On distingue une très faible bande pour [PS 22 h - GS].
Les 4 amplifications avec GDH ont donné un produit.

En regard du taux de dégénérescence des amorces et des origines biologiques distinctes entre les échantillons amplifiés et les séquences des amorces, il semble que les étapes de purification des ARNm et de synthèse des ADNc aient convenablement fonctionné.