Enoncé

Avec un spectrophotomètre, on peut mesurer l'absorbance, par un soluté, de l'énergie lumineuse d'un faisceau monochromatique.

L'absorbance est fonction de la concentration du soluté comme le montre la loi de Beer - Lambert : A = log (I_o/I) = ε . l . C

• A = absorbance (ou densité optique) sans unité
• I_o = intensité lumineuse incidente (avant interaction avec le soluté)
• I = intensité lumineuse transmise
• ε = coefficient d'extinction (qui dépend de la longueur d'onde) :
  • si la concentration du soluté est en M (ou mol.L^-1), ε est en M^-1.cm^-1 et on l'appelle coefficient d'extinction molaire ε _M
  • si la concentration du soluté est en % (m/v), ε est en g^-1.L.cm^-1 et on l'appelle coefficient d'extinction pondéral ε _1%
• l = longueur du trajet otique (en cm)
• C = concentration du soluté - l'unité dépend de celle du coefficient d'extinction

7a. Une solution d'un composé X à 2 % transmet 75 % de la lumière incidente à une longueur d'onde donnée. Calculez l'aborbance de cette solution et ε_M du composé X.

7b. Les protéases à sérine contiennent 11 tyrosines dont 10 sont accessibles au solvant à pH 7. La longueur d'onde d'absorbance maximale du groupement phénol est 277 nm à pH 7 et 297 nm à pH 13. Une solution d'élastase 50 µM a une absorbance de 0,7 à pH 7.

• Calculez le coefficient d'extinction molaire du groupement phénol.
• Calculez l'absorbance de cette solution à pH 13.

Données : M. M. de X = 250 ; pK_a phénol = 10,5 ; l = 1 cm ; ε _M ion phénolate = 2500 M^-1.cm^-1

Réponse

7a. [X] = 2% = 2 g / 100 mL = 20 g.l^-1 => [ X] = (20 g.l^-1 / 250 g.mol^-1) = 8 10^-2 M

• Calcul de ε _M avec une transmission de 75% = 0,75 : log (I_o/I) = ε _M . l . C => ε _M = log (1,00 / 0,75) / (1 x 8 10^-2) => ε _M = 1,56 M^-1.cm^-1

• Calcul de A : A = ε _M . l . C => A = 1,56 x 1 x 8 10^-2 => A = 0,125 = log (I_o/I)

7b. A pH 7, 10 des 11 tyrosines de l'élastase sont accessibles au solvant. Donc seules ces 10 Tyr contribuent à l'absorbance (en dehors des Trp et, dans une moindre mesure, des Phe de l'enzyme).

• Calcul de la concentration des 10 tyrosines accessibles au solvant à pH 7 : [élastase] = 50 10^-6 M => [Tyr]_accessibles = 10 x [élastase] = 500 10^-6 M

• Calcul du coefficient d'extinction molaire du groupement phénol des Tyr : A_{Tyr accessibles} = ε _M^{Tyr pH 7} . l . [Tyr]_accessibles => ε _M^{Tyr pH 7} = [0,7 / (1 x 500 10^-6)] = 1400 M^-1.cm^-1

Le groupement phénol des Tyr est ionisé en ion phénolate avec un pK_a = 10,5 :

L'ionisation induit une augmentation du coefficient d'extinction molaire (ε _M ion phénolate = 2500 M^-1.cm^-1) avec un décalage de la longueur d'onde d'absorbance maximale (273 - 277 nm -> 293 - 297 nm).

Calcul de l'absorbance de la solution d'élastase 50 µM à pH 13 : A_{élastase pH 13} = A_{Tyr accessibles} = ε_M^{Tyr pH 13} . l . [Tyr]_accessibles = 2500 x 1 x 500 10^-6 = 1,25