1. Les cuves pour les mesures

2. Loi de Beer - Lambert

3. Les spectrophotomètres

4. Spectres d'absorbance des acides aminés et des nucléotides

5. Exercice

La spectrophotomètrie est une méthodologie extrêmement courante pour :

• Déterminer la concentration d'une molécule.
• Suivre la cinétique de formation d'un produit au cours d'une réaction enzymatique.
• Mesurer l'absorbance d'un éluat au cours d'une séparation par chromatographie pour tracer le profil d'élution.
• Apprécier le degré de pureté d'une molécule purifiée.

Elle présente les avantages suivants :

• Les molécules biologiques sont en solution.
• C'est une méthode facile à mettre en oeuvre et les mesures sont simples à obtenir.
• Métode qui permet de tester l'effet de divers paramètres (pH, température, ...).
• L'appareillage est parmi les moins onéreux pour ce genre de gros matériel de laboratoire.

1. Les cuves pour les mesures

Précautions d'usage :

• Il faut choisir le type de cuve adaptée à la longeur d'onde :
  1. quartz pour les ultra-violets (190 - 400 nm)
  2. verre ou polystyrène pour le visible (400 nm - 800 nm)
• Ne pas mettre les doigts sur les faces dépolies des cuves
• Bien orienter la cuve par rapport à l'axe du faisceau lumineux
• Supprimer les bulles d'air

cuves en verre ou cuve en quartz (au milieu) et cuves jetables en polystyrène (à droite)

2. Loi de Beer - Lambert

L'absorbance est fonction de la concentration du soluté comme le montre la loi de Beer - Lambert : A = log (I_o/I) = ε . λ . C

• A = absorbance sans unité
• I_o = intensité lumineuse incidente (avant interaction avec le soluté)
• I = intensité lumineuse transmise
• ε = coefficient d'extinction (qui dépend de la longueur d'onde) :
  1. Si la concentration du soluté est en M (ou mol.L^-1), ε est en M^-1.cm^-1, c'est le coefficient d'extinction molaire : ε_M
  2. Si la concentration du soluté est en % (masse/volume), ε est en g^-1.L.cm^-1, c'est le coefficient d'extinction pondéral : ε_1%
• λ = longueur du trajet otique (en cm)
• C = concentration du soluté (l'unité dépend de celle du coefficient d'extinction

3. Les spectrophotomètres

Un spectrophotomètre analyse l'énergie lumineuse réflechie ou transmise d'une molécule. Il possède un système qui sépare les différentes longueurs d'onde d'un faisceau lumineux : le monochromateur. Il y a 2 types de monochromateur : dispersion de la lumière par un prisme ou diffraction de la lumière par un réseau ou par un cristal.

Le spectre est reconstruit par un logiciel à partir des mesures effectuées à des intervalles de longueur d'onde fixés (exemple : mesures tous les 1, 3, 5 nm, ...).

Sources lumineuses :

• Lampe à décharge au deutérium : domaine d'énergie / longueur d'ondes 190 à 400 nm (maximum d'émission à 652 nm).
• Lampe à filament de tungstène : domaine 350 à 800 nm.
• Lampe à décharge au xénon (très énergétique ) utilisée dans le domaine UV et visible. Elle fonctionne sous forme de flash, au moment de la mesure.

Figure ci-dessous : spectrophotomètre Perkin-Elmer modèle "Lambda 950". Ce type de spectrophotomètre "haut de gamme" délivre des longeurs d'onde allant de 190 nm à 1100 nm qui couvrent donc les régions de l'ultra-violet, du visible et du proche infra-rouge.

a. Un densitomètre mesure l'opacité d'un film (densitomètre par transmission) ou l'absorption de la lumière par un objet réfléchissant (densitomètre par réflexion).

b. Un colorimètre contient système de détection constitué d'un capteur associé à au moins 3 filtres interférentiels. Ces filtres ont des propriétés proches de celles des pics de la courbe spectrale de l'oeil humain pour simuler la réponse trichromatique de l'oeil.

c. Un spectrocolorimètre a plus de détecteurs qu'un colorimètre standard. Il mesure la réflectance spectrale d'un objet pour chaque longeur d'onde.

4. Spectres d'absorbance des acides aminés et des nucléotides

Précautions :

• Vérifier qu'il n'y a pas de bulle d'air dans la cuve.
• Enregistrer un spectre sur une large gamme de longueur d'onde avec comme point de départ une longueur d'onde où le soluté n'absorbe pas.

Figure ci-dessous : spectre d'absorbance d'une protéine.

Malgré son apparente simplicité, ce spectre est complexe puisqu'il est la résultante des spectres d'absorbance des acides aminés chromophores qui constituent la protéine.

Les acides aminés chromophores :

• Sont en nombre variable d'une protéine à l'autre.
• D'accessibilité variable (en surface ou enfouis à l'intérieur de la protéine).
• Ont des spectres d'absorbance caractérisés par des longueurs d'onde d'absorbance maximales distinctes (figure ci-dessous).
• Ont des coefficient d'extinction de valeurs trés différentes (tableau ci-dessous).
• Cette valeur dépend du pH puisque la tyrosine peut s'ioniser (tableau ci-dessous).

Remarque : les échelles ne sont pas identiques dans la figure ci-dessus : le spectre d'absorbance du Trp est représenté à l'échelle 1, celui de la Tyr a été multiplié par 2, celui de la Cys par 4 et celui de la Phe par 20.

En conséquence : à pH7, c'est essentiellement l'absorbance des Trp (selon leur nombre et leur accessibilité) que l'on mesure quand on enregistre le spectre d'absorbance d'une protéine ou que l'on mesure directement l'absorbance à 280 nm.

Le groupement phénol des Tyr s'ionise en ion phénolate avec un pK_a = 10,5. Cette ionisation induit :

• Une augmentation du coefficient d'extinction molaire : ε_M ion phénolate = 2500 M^-1.cm^-1. C'est l'effet hyperchrome.
• Une augmentation de la longueur d'onde d'absorbance maximale : 273 - 277 nm -> 293 - 297 nm. C'est l'effet bathochrome ("red shift").

En conséquence : à pH > 11, c'est essentiellement l'absorbance des Tyr (selon leur nombre et leur accessibilité) que l'on mesure quand on mesure l'absorbance à 295 nm.

Figure ci-dessous : spectres d'absorbance d'ADN simple brin à différents temps (5 à 180 min) d'exposition à des radiations ultra-violettes.

Source : Veligura et al. (2005) "UV induced ds(ss)-DNA damage: optical and electrical recognition" BMC Plant Biology 5, S32

5. Exercice

a. Une solution d'un composé X à 2 % transmet 75 % de la lumière incidente à une longueur d'onde donnée. Calculer l'aborbance de cette solution et ε_M du composé X.

b. Les protéases à sérine comme l'élastase contiennent 11 tyrosines dont 10 sont accessibles au solvant à pH 7. Une solution d'élastase 50 µM a une absorbance de 0,7 à pH 7.
A quelle longueur d'onde cette absorbance est-elle mesurée ?
Calculer le coefficient d'extinction molaire du groupement phénol.
Calculer l'absorbance de cette solution à pH 13.

• M. M. de X = 250
• pK_a phénol = 10,5
• l = 1 cm
• ε_M ion phénolate = 2500 M^-1.cm^-1

Voir la solution.