I. Généralités sur la chromatographie

1. Description
2. Paramètres intervenant dans la séparation
3. Tableau résumé des différents types de chromatographie
4. Les supports ou matrices pour phases stationnaires

II. Chromatographie d'échange d'ions

1. Les différents types d'échangeurs d'ions 
2. Principe

III. Chromatographie d'exclusion ou filtration sur gel

1. Remarque préliminaire
2. Principe
3. Détermination de la masse molaire d'une molécule

IV. Chromatographie d'affinité

1. Principe et applications
2. Structure de gels d'affinité - Activation du gel pour le couplage du ligand - Bras espaceurs

V. Interactions hydrophobes

V.A. Chromatographie à polarité de phase inversée ou en phase reverse

1. Structure du gel de silice
2. Principe de l'adsorption et de la désorption en phase reverse
3. Exemples d'application

V.B. Chromatographie d'interactions hydrophobes

1. Principe
2. Quelques particularités de la chromatographie d'interactions hydrophobes

VI. Chromatographie de partage et chromatographie d'adsorption

VII. Avantages et inconvénients des différents types de chromatographie liquide / solide

VIII. Liens Internet et références bibliographiques

I. Généralités sur la chromatographie

1. Description

La chromatographie est une technique d'analyse pour séparer les constituants d'un mélange ;

• les molécules à séparer sont entraînées par un fluide (un liquide ou un gaz) que l'on appelle la phase mobile.
• elles interagissent ou au contraire n'interagissent pas avec un support (ou matrice) fixe (un solide ou un liquide fixé) que l'on appelle la phase stationnaire : il y a donc une distribution ou partition des composants entre ces deux types de phase.
• le flux du fluide vecteur étant continu, c'est la rétention plus ou moins longue des différentes molécules sur le support fixe, qui va les séparer les unes des autres.

Historiquement, c'est au russe Mikhaïl Semenovivch Tswett (1872 - 1919) que l'on doit la première publication (1906) de travaux de chromatographie, ayant utilisé cette technique pour séparer les pigments d'épinard (voir historique 1 et historique 2 du cours "Chromatographie" - 123bio.net).

Le mot chromatographie vient du grec "kroma" (couleur) et "graphein" (écrire).

2. Paramètres intervenant dans la séparation

Les paramètres physico-chimiques sur lesquels reposent les principes de séparation sont :

Cependant, si un type de chromatographie repose sur une caractéristique physico-chimique donnée, la séparation peut être influencée de manière "secondaire" par d'autres caractéristiques.

Par exemple :

• un échangeur d'ions comportant un groupement hydrophobe, comme le noyau phényl du "DOWEX", interagit aussi par interactions hydrophobes : ainsi pour 2 acides aminés de charge identique, l'hydrophobicité de la chaîne latérale influencera en second lieu la séparation de ces molécules.
• un gel de filtration "Sephadex" peut être utilisé comme gel d'affinité pour les protéines qui fixent les dérivés du glucose tel que le dextran.

4. Les supports ou matrices pour phases stationnaires

Le support ou matrice utilisé pour constituer la phase stationnaire s'appelle un gel de résine.

Ce gel se présente souvent sous la forme de billes (sphériques ou, plus rarement, de forme irrégulière). Ces billes sont elles mêmes des polymères de différents types de molécules, par exemple :

• de styrène - divinylbenzène pour certaines résines d'échange d'ions
• de polyholosides pour les gels de filtration
• de silice pour la chromatographie en phase reverse

II. Chromatographie d'échange d'ions

1. Les différents types d'échangeurs d'ions

Les échangeurs d'ions sont des billes qui portent des groupements ionisables dont la charge est :

2. Principe.

Dans un premier temps, la résine est équilibrée dans un tampon dont le pH est tel que le groupement porté par l'échangeur d'ions soit ionisé :

• dans le cas d'une base (échangeur d'anions), le pH doit être inférieur au pK_a du groupement ionisable (exemple : le pK_a du groupement diéthylaminoéthylammonium est 9,5)
• dans le cas d'un acide (échangeur de cations), le pH doit être supérieur au pK_a du groupement ionisable (exemple : le pK_a du groupement carboxyméthyl est 4)

• négative : le pI de l'albumine de sérum bovin est 4,9, cette protéine est chargée négativement à pH 7
• nulle
• positive : le pI du cytochrome c est 10,7, cette protéine est chargée positivement à pH 7

Voir un exemple de la variation de la charge nette d'une protéine en fonction du pH

Voir la relation de Henderson - Hasselbach.

• En modifiant le pH de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui sont chargées ne le soient plus (ou qu'elles portent une charge de même signe que l'échangeur d'ions) ; il n'y a plus alors d'interaction électrostatique entre les molécules et le groupement chargé porté par la résine et les molécules sont éluées.
• En ajoutant un sel (à une concentration croissante) qui apporte forcément un ion de même charge que les molécules fixées à la résine : cet ion s'appelle un contre - ion.

• cations monovalents : Li⁺ < H⁺ < Na⁺ < NH₄⁺
• cations divalents : Cd₂⁺ < Mn₂⁺ < Mg₂⁺ < Zn₂⁺ < Cu₂⁺ < Ca₂⁺ 
• de plus, l'efficacité augmente avec la charge : K⁺ < Ca₂⁺ < Al₃⁺

III. Chromatographie d'exclusion ou filtration sur gel

1. Remarque préliminaire

Le principe de la chromatographie d'exclusion (appelée aussi filtration sur gel ou tamisage moléculaire ou chromatographie de perméation) repose en première approximation sur la masse molaire des molécules à séparer.

En toute rigueur, le paramètre physico-chimique qui intervient est la dimension des molécules, donc leur volume et donc plus précisément leur rayon de Stokes. Mais cette relation univoque [masse molaire - rayon de Stokes] n'est valable que pour des protéines dites "globulaires", c'est-à-dire assimilées à des sphères.

Différents paramètres influencent le volume des molécules et peuvent fausser la détermination de la masse molaire réelle par ce type de chromatographie :

• la géométrie : pour une même masse molaire, une protéine "allongée" (exemple, la calmoduline) n'aura pas les mêmes dimensions qu'une protéine globulaire.
• les modifications post-traductionnelles : par exemple, les longues chaînes d'oses modifient fortement la géomètrie des protéines glycosylées et les rend plus denses ; à l'inverse, les lipoprotéines sont "allégées" par la présence de lipides.
• la présence de sels, d'agents chaotropiques, de détergents ... 

2. Principe.

La phase stationnaire est constituée de billes de polysaccharides (type "Sephadex" ou "Sepharose") gonflées dans le solvant utilisé pour l'élution :

• le volume des billes est très finement calibré.
• ainsi les molécules dont le volume est supérieur à celui des billes ne peuvent y pénétrer et sont éluées rapidement.
• en revanche, les molécules dont le volume est inférieur à celui des billes y pénétrent et y subissent des frottements qui les retardent.

En conclusion, si l'on connait la masse molaire de la molécule que l'on veut séparer d'un mélange par cette technique, il faut choisir le gel le mieux adapté : c'est celui dont le domaine de fractionnement, c'est-à-dire la gamme des masses molaires pour lesquelles il y a diffusion partielle ou totale, englobe la masse molaire de la molécule à purifier (voir un exemple).

3. Détermination de la masse molaire d'une molécule.

Un mélange de molécules que l'on appelle standards, de masses molaires connues, est séparé par chromatographie de filtration sur gel (voir un exemple de séparation) :

• chaque molécule est éluée avec un volume d'élution V_e.
• par ailleurs, le volume d'exclusion du gel (V₀) est le volume d'élution d'une molécule non retardée par le gel, c'est-à-dire une molécule de taille supérieure à celle des billes et qui n'y diffuse pas. Bien souvent, on utilise le bleu dextran, polymère d'ose de masse molaire supérieure à 2 10⁶ Da.
• enfin, le volume total du gel (V_t) est la somme du volume des billes et du volume externe aux billes : il est donné par le volume d'élution d'une molécule qui diffuse totalement dans les billes et qui est donc totalement retardée.

On définit le coefficient de partition :

             V_e - V₀
K_D = -----------
             V_t - V₀

• on trace la droite étalon : log (masse molaire) = f (K_D) (ou masse molaire = f (K_D) sur une échelle semi-logarithmique)
• on détermine le volume d'élution d'une molécule X dans les mêmes conditions de chromatographie que pour le mélange des standards
• on reporte le K_D de la molécule X sur la partie linéaire de la droite étalon et ainsi on détermine sa masse molaire 

IV. Chromatographie d'affinité

1. Principe et applications

C'est le type de chromatographie le plus sélectif, une protéine pouvant être purifiée d'un facteur 10³ à 10⁴ en une seule fois.

Le principe de la chromatographie d'affinité repose sur la reconnaissance entre une molécule du mélange à séparer et une molécule greffée sur la résine, que l'on appelle le ligand, ces deux molécules interagissant de manière hautement spécifique :

• l'adsorption de la molécule à séparer sur le ligand fixé à la résine est effectuée dans des conditions physico-chimiques (pH, force ionique, concentration de la molécule à adsorber...) favorables à la liaison molécule - ligand.
• dans ces conditions, les molécules du mélange à séparer qui n'ont pas (ou peu) d'affinité pour le ligand sont éluées au fur et à mesure qu'on le fait passer sur la résine.
• on désorbe ensuite les molécules spécifiquement fixées au ligand en modifiant les conditions physico-chimiques de telle sorte que la liaison molécule - ligand soit rompue : le plus souvent, on ajoute une tierce molécule qui entre en compétition avec le ligand greffé pour la molécule à séparer. En d'autres termes, on déplace l'équilibre de liaison molécule - [ligand greffé] en faveur de l'équilibre molécule - [tierce molécule].

Cette tierce molécule peut-être :

• le ligand greffé lui-même (sous forme libre) à une concentration plus élevée que celle du ligand greffé
• une molécule dont la structure est analogue à celle du ligand greffé mais pour laquelle la molécule a plus d'affinité

L'une des principales applications de la chromatographie d'affinité est l'isolement de protéines ou d'acides nucléiques dont voici quelques exemples :

2. Structure de gels d'affinité - Activation du gel pour le couplage du ligand - Bras espaceurs

Les supports ou matrices utilisés pour la chromatographie d'affinité peuvent être des billes d'agarose ("Sepharose", Pharmacia), de polyacrylamide d'agarose, de verre poreux, de polyvinyle, de polyméthacrylate ...

L'immobilisation du ligand sur la matrice nécessite qu'il soit préalablement activé, c'est-à-dire qu'il faut créer des sites réactionnels qui permettent d'établir des liaisons covalentes. Parmi les diverses méthodes d'activation, on peut citer :

• l'activation des groupes hydroxyles du support (l'agarose par exemple) par le bromure de cyanogène dans une solution dont le pH est finement contrôlé (pH 8,3). Des groupements imidocarbonates sont formés sur lesquels on peut fixer des ligands contenant des amines libres, par exemple une protéine par la chaîne latérale de ces lysines. Les groupes hydroxyles qui n'ont pas réagit sont bloqués par action de l'éthanolamine ou la glycine.
• les groupes hydroxyles du support peuvent être activés par le carbonyl di-imidazole.
• l'activation du support peut être faite avec le gtutaraldéhyde qui se polymérise et forme des chaînes à 5 carbones qui constituent des points de fixation à une certaine distance de la matrice.
• une autre méthode d'activation utilise le chlorure de tosyle et elle permet le couplage de molécules qui possèdent un groupement aminé, thiol ou phénol.

La chromatographie d'affinité est la méthode la plus sélective. Cependant, c'est aussi la plus délicate à mettre en oeuvre car elle nécessite la mise au point des conditions expérimentales idoines pour obtenir un gel correctement activé : 

• le ligand doit être orienté de manière optimale pour une parfaite reconnaissance stéréochimique de la molécule que l'on veut séparer
• il ne faut pas que le ligand subisse l'action des enzymes, c'est pour celà qu'on utilise davantage des analogues de substrats (inhibiteurs compétitifs par exemple) que les substrats eux-mêmes
• il faut trouver des conditions d'élution de la molécule fixée au ligand qui préserve sa fonction biologique
• en conséquence, cette méthode chromatographique est coûteuse

V. Chromatographie d'adsorption à polarité de phase inversée ou phase reverse

V.A. Chromatographie à polarité de phase inversée ou en phase reverse

1. Structure du gel de silice

Les matrices pour chromatographie en phase reverse sont souvent à base de silice (SiO₂), appelée aussi gel de silice car elle est plus ou moins hyratée :

• la silice provient de la déshydratation de l'acide silicique et se présente sous forme d'une poudre dont les grains (les billes) sont très fins
• ces billes peuvent être sphériques ou irrégulières
• à la surface de la silice on trouve des groupes silanols (-OH) et des groupes siloxanes (-O-) qui lui confèrent un caractère polaire et acide et qui lui permettent de former des liaisons hydrogènes
• on utilise fréquemment une silice sur laquelle des chaînes alkylées (ou autres, voir les différents groupes utilisés) sont greffées au niveau des groupements silanols

2. Principe de l'adsorption et de la désorption en phase reverse (voir un schéma)

Les chaînes alkylées confère à la silice un caractère très hydrophobe : 

• si la phase mobile est très polaire (donc très peu hydrophobe), certaines molécules hydrophobes vont établir des interactions hydrophobes avec la phase stationnaire et ainsi être adsorbées
• on augmente alors la concentration en solvant organique (apolaire donc hydrophobe) dans la phase mobile
• à une concentration donnée l'hydrophobicité de la phase mobile étant plus importante que celle de la phase stationnaire, les molécules hydrophobes sont désorbées et éluées

a. la phase aqueuse :

• l'eau est le solvant le plus polaire (le moins hydrophobe).

On ajoute un sel pour tamponner le milieu. Cependant, on emploie souvent un acide fort (l'acide trifluoroacétique) et une amine quaternaire (la triéthylamine, par exemple) car ces deux composés ioniques forment des paires d'ions avec les molécules à séparer, neutralisant ainsi des charges portées par ces dernières. Celà a pour conséquence d'augmenter l'hydrophobicité des molécules et ainsi qu'elles s'adsorbent davantage sur la phase stationnaire.

b. le solvant organique :

• il en existe un grand nombre que l'on peut utiliser puisque la silice leur résiste. Cependant, les plus employés sont l'acétonitrile et le méthanol.
• le choix du solvant organique dépend grandement de l'hydrophobicité des molécules à séparer : pour des molécules très hydrophobes, on peut choisir d'utiliser une forte concentration d'un solvant organique de polarité moyenne ou une faible concentration d'un solvant organique de polarité faible.
• les solvants organiques ne doivent pas comporter d'impurétés ni avoir une forte absorbance aux faibles longueurs d'onde (ultra-violet) pour ne pas interférer avec les propriétés optiques des molécules à séparer. De plus selon sa qualité, on peut ou non utiliser un solvant organique pour un type d'analyse donnée. En conséquence, il faut prendre des solvants certifiés "ultra-purs" qui coûtent chers. 

3. Exemples d'application

La chromatographie en phase reverse s'applique quasiment à tous les types de molécules. C'est une méthode de chromatographie extrêmement efficace qui permet de séparer des échantillons complexes.

Parmi les applications, on peut citer la détermination de la séquence primaire des protéines par la dégradation de Pehr Edman :

• la fonction a-aminée de l'acide aminé en position N-terminale de la chaîne polypeptidique d'une protéine (ou d'un polypeptide) est traitée à pH alcalin par l'isothiocyanate de phényle (PITC), appelé aussi réactif d'Edman.
• après action d'acides et de solvant organique, la liaison peptidique liant l'acide aminé en position N-terminale est spécifiquement coupée. 
• l'analyse des des acides aminés libres (voir un exemple d'application à Medicago truncatula).

V. B. Chromatographie d'interactions hydrophobes

On peut considérer que ce type de chromatographie est une "variante" de la chromatographie en phase reverse, puisque l'adsorption des molécules sur la phase stationnaire met en jeu le même type d'interactions.

Les gels de chromatographie d'interactions hydrophobes portent un groupement hydrophobe à l'extrémité d'une chaîne carbonée.

1. Principe.

Quand un composé hydrophobe se trouve dans un environnement polaire comme l'eau, il en résulte un état thermodynamiquement défavorable. L'interaction hydrophobe est la conséquence de deux phénomènes opposés : une augmentation de l'entropie des molécules d'eau autour du composé hydrophobe (c'est-à-dire une diminution de leur organisation) concomittante à une diminution de l'entropie du composé hydrophobe.

1ère étape (voir le schéma) : On fixe la protéine à séparer sur le support chromatographique en présence d'une forte concentration en sel :

• dans un milieu à haute force ionique, les molécules d'eau de l'enveloppe d'hydratation des protéines sont "mobilisées" pour hydrater les anions et les cations issus de la dissociation du sel, c'est le phénomène de "salting -out".
• il en résulte une modification de l'organisation des molécules d'eau autour des protéines et ce changement d'environnement est favorable (comme celà est défini ci-dessus) à l'établissement d'interactions hydrophobes entre les régions hydrophobes à la surface des protéines et le groupement hydrophobe porté par la phase stationnaire.

• en faisant passer un tampon de force ionique décroissante, les ions du sel étant ainsi progressivement éliminés.
• les acides aminés chargés ou polaires à la surface des protéines peuvent de nouveau établir des liaisons hydrogène avec la phase mobile, c'est-à-dire que la solubilité des protéines dans la phase mobile redevient maximale et elles sont éluées.

• ajouter un ion aux propriétés chaotropiques qui induit une diminution de l'organisation des molécules d'eau (donc une augmentation de leur entropie) : la force des interactions hydrophobes est ainsi diminuée.
• ajouter un détergent / augmenter le pH / diminuer la température puisque la force des interactions hydrophobes diminue avec celle -ci.

2. Quelques particularités de la chromatographie d'interactions hydrophobes.

Le choix de la matrice : 

• la densité du ligand fixé sur les matrices utilisées pour la chromatographie d'interactions hydrophobes est moindre que celle des supports de phase reverse. 
• le profil d'hydrophobicité d'une protéine dépend essentiellement de la présence et de la répartition des acides aminés : Ile, Leu, Val et Phe. Donc pour une protéine donnée, on ne peut déterminer le support de chromatographie d'interactions hydrophobes le mieux adapté qu'en testant différents types de gels.
• cependant, le meilleur choix pour commencer est un gel avec un groupement phényl. En effet, ce groupement est d'hydrophobicité intermédiaire entre le n - butyl et le n - pentyl. Par ailleurs, les protéines très hydrophobes ne sont pas facilement éluées des gels contenant le groupement octyl.

• anions : PO₄^3- > SO₄^2- >CH₃COO^- >Cl^- > Br^- > NO₃^- > SCN^- 
• cations : NH₄⁺ > Rb⁺ > K⁺ > Na⁺ > Li⁺ > Mg²⁺ > Ca²⁺ > Ba²⁺ 

Remarque pratique : l'inconvénient de la chromatographie d'échange d'ions (voir le tableau comparatif) est que l'on obtient la molécule séparée dans un tampon qui contient une forte concentration en sel et, bien souvent, on ne peut l'utiliser dans de telles conditions.

Pour éliminer le sel (ou "dessaler") on peut soit :

• dialyser l'échantillon : c'est une méthode délicate qui induit beaucoup de pertes (elle nécessite donc d'avoir une grande quantité initiale de matériel)
• enchaîner sur une chromatographie de gel de filtration (en utilisant un gel qui fractionne dans le domaine des faibles masses molaires)
• enchaîner sur une chromatographie d'interactions hydrophobe puisqu'elle recquière une forte concentration en sel pour que la molécule s'adsorbe

En fait, la chromatographie de partage et la chromatographie l'adsorption peuvent être rapprochés :

• en effet, la solubilité et l'adsorption sont deux phénomènes liés aux forces de Van der Waals et aux affinités respectives du composant C dans chacune des deux phases.
• par ailleurs, la relation 1 n'est qu'un cas particulier de la loi de Freundlich.