La chromatographie liquide |
Tweet |
I. Généralités sur la chromatographie
II. Chromatographie d'échange d'ions III. Chromatographie d'exclusion ou filtration sur gel
IV. Chromatographie d'affinité
|
V. Interactions hydrophobes
VI. Chromatographie de partage et chromatographie d'adsorption VII. Avantages et inconvénients des différents types de chromatographie liquide / solide VIII. Liens Internet et références bibliographiques |
I. Généralités sur la chromatographie La chromatographie est une technique d'analyse pour séparer les constituants d'un mélange ;
Historiquement, c'est au russe Mikhaïl Semenovivch Tswett (1872 - 1919) que l'on doit la première publication (1906) de travaux de chromatographie, ayant utilisé cette technique pour séparer les pigments d'épinard (voir historique 1 et historique 2 du cours "Chromatographie" - 123bio.net). Le mot chromatographie vient du grec "kroma" (couleur) et "graphein" (écrire). 2. Paramètres intervenant dans la séparation Les paramètres physico-chimiques sur lesquels reposent les principes de séparation sont : |
paramètres | type de chromatographie | domaine d'application |
la charge électrique | échange d'ions |
|
la taille et la forme (en fait, le volume) | exclusion ou gel de filtration |
|
l'existence de structures
particulières qui permettent
d'établir des liaisons spécifiques |
affinité |
|
la polarité
et/ou l'hydrophobicité |
polarité de phase
inversée
ou phase reverse |
|
interactions hydrophobes |
|
Cependant, si un type de chromatographie repose sur une caractéristique physico-chimique donnée, la séparation peut être influencée de manière "secondaire" par d'autres caractéristiques. Par exemple :
|
3. Tableau résumé des différents types de chromatographie |
phase stationnaire | principe de séparation | catatéristiques de la phase stationnaire | principe de la fixation et de l'élution |
liquide | partage | liquide fixé sur un support inerte (papier, silice...) | distribution des composants du mélange à séparer dans les deux phases liquides selon leur coefficient de partage |
solide | adsorption | adsorbant solide polaire | phénomène de surface : formation de liaisons spécifiques entre les composants et la surface adsorbante |
adsorption (phase inverse) | molécules hydrophobes greffées sur de la silice | interactions hydrophobes et élution par diminution de la polarité de la phase mobile | |
échange d'ions | résine (polymères d'oses) porteuse de groupements chargés négativement ou positivement | interactions électrostatiques avec les composants de charge opposée | |
exclusion (filtration sur gel) | solide poreux | les composants de diamètre supérieur à celui des billes du support sont "exclus" et ceux de diamètre inférieur y diffusent et sont freinés | |
affinité | support sur lequel est greffée une molécule (le ligand) spécifiquement reconnue par un des composants de l'échantillon à analyser | déplacement de l'équilibre de liaison [molécule - ligand greffé] en faveur de l'équilibre [molécule - tierce molécule] |
4. Les supports ou matrices pour phases stationnaires Le support ou matrice utilisé pour constituer la phase stationnaire s'appelle un gel de résine. Ce gel se présente souvent sous la forme de billes (sphériques ou, plus rarement, de forme irrégulière). Ces billes sont elles mêmes des polymères de différents types de molécules, par exemple :
|
II. Chromatographie d'échange d'ions 1. Les différents types d'échangeurs d'ions Les échangeurs d'ions sont des billes qui portent des groupements ionisables dont la charge est : |
positive : résines échangeuses d'anions qui fixent des molécules chargées négativement : ---R+...M- | négative : résines échangeuses de cations qui fixent des molécules chargées positivement : ---R-...M+ | ||
nature de la fonction ionisable : ---R+ | nature de la fonction ionisable : ---R- | ||
base forte | base faible | acide fort | acide faible |
ammonium quaternaire : ---NR3+ exemple : triméthylammonium ---N(CH3)3+ |
forme protonnée d'une amine I, II ou III : ---NHR2+ exemple : diéthylaminoéthylammonium |
exemple : sulfonate ---SO3- |
exemple : carboxyméthyl ---O-CH2-CO2- |
Dans un premier temps, la résine est équilibrée dans un tampon dont le pH est tel que le groupement porté par l'échangeur d'ions soit ionisé :
Voir un exemple de la variation de la charge nette d'une protéine en fonction du pH Voir la relation de Henderson - Hasselbach. Il y a deux manières d'éluer les molécules fixées sur la résine :
|
III. Chromatographie d'exclusion ou filtration sur gel Le principe de la chromatographie d'exclusion (appelée aussi filtration sur gel ou tamisage moléculaire ou chromatographie de perméation) repose en première approximation sur la masse molaire des molécules à séparer. En toute rigueur, le paramètre physico-chimique qui intervient est la dimension des molécules, donc leur volume et donc plus précisément leur rayon de Stokes. Mais cette relation univoque [masse molaire - rayon de Stokes] n'est valable que pour des protéines dites "globulaires", c'est-à-dire assimilées à des sphères. Différents paramètres influencent le volume des molécules et peuvent fausser la détermination de la masse molaire réelle par ce type de chromatographie :
La phase stationnaire est constituée de billes de polysaccharides (type "Sephadex" ou "Sepharose") gonflées dans le solvant utilisé pour l'élution :
En conclusion, si l'on connait la masse molaire de la molécule que l'on veut séparer d'un mélange par cette technique, il faut choisir le gel le mieux adapté : c'est celui dont le domaine de fractionnement, c'est-à-dire la gamme des masses molaires pour lesquelles il y a diffusion partielle ou totale, englobe la masse molaire de la molécule à purifier (voir un exemple). 3. Détermination de la masse molaire d'une molécule. Un mélange de molécules que l'on appelle standards, de masses molaires connues, est séparé par chromatographie de filtration sur gel (voir un exemple de séparation) :
On définit le coefficient de partition :
Ve - V0
|
IV. Chromatographie d'affinité C'est le type de chromatographie le plus sélectif, une protéine pouvant être purifiée d'un facteur 103 à 104 en une seule fois. Le principe de la chromatographie d'affinité repose sur la reconnaissance entre une molécule du mélange à séparer et une molécule greffée sur la résine, que l'on appelle le ligand, ces deux molécules interagissant de manière hautement spécifique :
Cette tierce molécule peut-être :
L'une des principales applications de la chromatographie d'affinité est l'isolement de protéines ou d'acides nucléiques dont voici quelques exemples : |
ligand | exemples de molécules isolées |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2. Structure de gels d'affinité - Activation du gel pour le couplage du ligand - Bras espaceurs Les supports ou matrices utilisés pour la chromatographie d'affinité peuvent être des billes d'agarose ("Sepharose", Pharmacia), de polyacrylamide d'agarose, de verre poreux, de polyvinyle, de polyméthacrylate ... L'immobilisation du ligand sur la matrice nécessite qu'il soit préalablement activé, c'est-à-dire qu'il faut créer des sites réactionnels qui permettent d'établir des liaisons covalentes. Parmi les diverses méthodes d'activation, on peut citer :
La chromatographie d'affinité est la méthode la plus sélective. Cependant, c'est aussi la plus délicate à mettre en oeuvre car elle nécessite la mise au point des conditions expérimentales idoines pour obtenir un gel correctement activé :
|
V. Chromatographie d'adsorption à polarité de phase inversée ou phase reverse V.A. Chromatographie à polarité de phase inversée ou en phase reverse Les matrices pour chromatographie en phase reverse sont souvent à base de silice (SiO2), appelée aussi gel de silice car elle est plus ou moins hyratée :
2. Principe de l'adsorption et de la désorption en phase reverse (voir un schéma) Les chaînes alkylées confère à la silice un caractère très hydrophobe :
a. la phase aqueuse :
On ajoute un sel pour tamponner le milieu. Cependant, on emploie souvent un acide fort (l'acide trifluoroacétique) et une amine quaternaire (la triéthylamine, par exemple) car ces deux composés ioniques forment des paires d'ions avec les molécules à séparer, neutralisant ainsi des charges portées par ces dernières. Celà a pour conséquence d'augmenter l'hydrophobicité des molécules et ainsi qu'elles s'adsorbent davantage sur la phase stationnaire. b. le solvant organique :
La chromatographie en phase reverse s'applique quasiment à tous les types de molécules. C'est une méthode de chromatographie extrêmement efficace qui permet de séparer des échantillons complexes. Parmi les applications, on peut citer la détermination de la séquence primaire des protéines par la dégradation de Pehr Edman :
|
V. B. Chromatographie d'interactions hydrophobes On peut considérer que ce type de chromatographie est une "variante" de la chromatographie en phase reverse, puisque l'adsorption des molécules sur la phase stationnaire met en jeu le même type d'interactions. Les gels de chromatographie d'interactions hydrophobes portent un groupement hydrophobe à l'extrémité d'une chaîne carbonée. Quand un composé hydrophobe se trouve dans un environnement polaire comme l'eau, il en résulte un état thermodynamiquement défavorable. L'interaction hydrophobe est la conséquence de deux phénomènes opposés : une augmentation de l'entropie des molécules d'eau autour du composé hydrophobe (c'est-à-dire une diminution de leur organisation) concomittante à une diminution de l'entropie du composé hydrophobe. 1ère étape (voir le schéma) : On fixe la protéine à séparer sur le support chromatographique en présence d'une forte concentration en sel :
2. Quelques particularités de la chromatographie d'interactions hydrophobes. Le choix de la matrice :
Remarque pratique : l'inconvénient de la chromatographie d'échange d'ions (voir le tableau comparatif) est que l'on obtient la molécule séparée dans un tampon qui contient une forte concentration en sel et, bien souvent, on ne peut l'utiliser dans de telles conditions. Pour éliminer le sel (ou "dessaler") on peut soit :
|
VI. Chromatographie de partage et chromatographie d'adsorption |
chromatographie de partage : liquide / liquide |
chromatographie d'adsorption : liquide / solide |
Si l'on considère :
on a :
C2 |
La phase stationnaire est solide (adsorbant pulvérulant) et non ionique. La concentration C2 du composant C adsorbé par unité de masse de phase stationnaire est donnée par la loi de Freundlich ou loi de Langmuir : C2 = K . C1n (avec n inférieur ou égal à 1) ou bien encore : |
|
En fait, la chromatographie de partage et la chromatographie l'adsorption peuvent être rapprochés :
|
VII. Avantages et inconvénients des différents types de chromatographie liquide / solide |
caractéristiques | échange d'ions | filtration sur gel | affinité | phase reverse | interactions hydrophobes |
résolution de la séparation | moyenne à élevée | moyenne à élevée | exceptionnelle | élevée pour les protéines et les polypeptides de faible masse molaire | moyenne |
concentration de la molécule d'intérêt à l'issue de la chromatographie | augmentée | souvent diminuée | augmentée | augmentée | augmentée |
recouvrement de l'activité enzymatique | bon | bon | bon | la phase mobile organique peut dénaturer les enzymes | bon |
capacité de rétention (fixation) du gel | élevée | moyenne | élevée | moyenne | élevée |
régéneration du gel | supporte l'action d'une base forte | domaines d'application très nombreux | ne supporte pas les agents chimiques agressifs | ne supporte pas les agents chimiques agressifs | supporte l'action d'une base forte |
autres | domaines d'application très nombreux | ------- | domaines d'application restreints | domaines d'application très nombreux | domaines d'application restreints |
nécessité de "dessaler" l'échantillon à l'issue de la chromatographie | permet le dessalage d'échantillons | nécessité de coupler le ligand d'où un coût élevé du gel | ------- | nécessité de "dessaler" l'échantillon à l'issue de la chromatographie |
VIII. Liens Internet et références bibliographiques |
Wikipédia : portail "Chromatography" (version anglaise plus complète que la version farnçaise). Site trés complet sur la chromatographie et d'autres techniques. Société Waters LEA Database |
|
"Enzymes : catalyseurs du monde vivant " Jean Pelmont (1995), Presses Universitaires de Grenoble - ISBN : 2-7061-0655-7 "Principes de Biochimie" Horton, Moran, Ochs, Rawn et Scrimgeour (1994), Ed. DeBoeck Universités - ISBN : 2-8041-1578-X |