Licence texte Travaux diriges enzymologie inhibition competitive non incompetitive Enseignement et recherche Biochimie Emmanuel Jaspard Universite Angers biochimej

Enzymologie : inhibitions compétitive, non compétitive et incompétitive

Exercice N°1

Enzymology kinetics parameter inhibition non competitive incompetitive kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme enzymologie Michaelis Menten Henri Lineweaver Burk biochimej

Inhibiteur	1/V_Max ou 1/V_Max^app (ΔA^-1.min)	V_Max ou V_Max^app (ΔA.min^-1)	V_Max ou V_Max^app (µM.min^-1)	-1/K_M ou -1/K_M^app (mM^-1)	K_M ou K_M^app (mM)	Type d'inhibition	K_I(M)
SANS	6,1	0,163	50	-10	0,1	-----	-----
ONPTG	6,1	0,163	50	-5	0,2	compétitive	3 10^-4
Maltose	12,1	0,083	25	-10	0,1	non compétitive	0,26
Mélibiose	12,1	0,083	25	-20	0,05	incompétitive	0,17
Formules pour K_I Inhibition compétitive : K_I = (K_M . [I₀]) / (K_M^app - K_M) Inhibition non compétitive : K_I = (V_Max^app . [I₀]) / (V_Max - V_Max^app) Inhibition incompétitive : K_I = (V_Max^app . [I₀]) / (V_Max - V_Max^app) ou K_I = (K_M^app . [I₀]) / (K_M - K_M^app)

Expression de V_max en fonction de la concentration

Enzymology kinetics parameter kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme Lineweaver Burk enzymologie biochimejEnzymology kinetics parameter kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme Lineweaver Burk enzymologie biochimej

Une vitesse enzymatique est la variation d'une concentration par unité de temps, donc on recalcule V_max avec la loi de Beer-Lambert (ε_M^produit = 3300 M^-1.cm^-1; longueur du trajet optique l = 1 cm) :

V_max= [0,163 UA.min^-1 / (3300 M^-1.cm^-1 x 1 cm)] # 49,7 10^-6 M.min^-1 # 50 µM.min^-1

Calcul de k_cat

k_cat = V_max / [E₀] = (49,7 10^-6 M.min^-1 /1,19 10^-9 M) = 41745 min^-1 = 696 s^-1

Il faut diviser par 60 pour passer des min^-1 en s^-1 puisque l'acte catalytique a lieu 60 fois moins souvent en 1 seconde que en 1 minute.

Remarque importante

V_max^app < V_max en présence d'un inhibiteur non compétitif ou incompétitif car [E₀]^app < [E₀] (une partie de l'enzyme est complexée à l'inhibiteur - formes EI ou ESI).

Malgré tout k_cat est une caractéristique de l'enzyme et sa valeur est indépendante de la présence de l'inhibiteur : la valeur de k_cat en présence d'inhibiteur est donc inchangée (k_cat = V_max / [E₀] = V_max^app / [E₀]^app).

Explications des types d'inhibitions observées

Le substrat synthétique de la β-galactosidase est l'orthonitrophényl-β-D-galactopyranoside (ONPG). C'est un substrat très souvent employé en travaux pratiques pour la mesure de l'activité de cette enzyme. En effet, la cinétique de formation du produit (o-nitrophénol) est très facile à suivre avec un spectrophotomètre puisqu'il absorbe à 410 nm.

Dans la structure de l'ONPTG, un atome de soufre (plus encombrant stériquement) remplace l'oxygène de la liaison osidique hydrolysée.

ONPG ONPTG orthonitrophenyl galactoside thiogalactoside inhibition non competitive incompetitive biochimej

rayon de van der Waals du soufre = 1,04 Å
rayon de van der Waals de l'oxygène = 0,74 Å

L'ONPTG est donc un analogue structural de l'ONPG mais l'atome de soufre empêche l'acte catalytique.

Le maltose : ce diholoside est libéré par hydrolyse de l'amylose qui est un polymère de résidus glucose : il s'agit de l'α-D-glucopyranosyl-(1,4)-β-D-glucopyranose. Les résidus de glucose sont libérés par hydrolyse chimique ou par une enzyme : l'α-D-glucosidase.

ONPG maltose cellobiose orthonitrophenyl galactoside thiogalactoside inhibition non competitive incompetitive biochimej

Le maltose peut se fixer sur l'enzyme libre E et sur le complexe intermédiaire ES (inhibition non compétitive).

Le mélibiose : ce diholoside est l'α-D-galactopyranosyl-(1,6)-α-D-glucopyranose.