Les glucides à la surface des cellules (glycolipides et glycoprotéines) jouent un rôle clé dans les mécanismes de reconnaissance des cellules et de leur environnement.

Les interactions spécifiques et réversibles entre ces glucides et les récepteurs protéiques (les lectines) sont capitales dans de nombreux processus biologiques et pathologiques.

Ces interactions lectine - glucides ont une haute spécificité et une faible affinité envers leur ligand glucidique. Cette faible affinité est compensée :

• Par l'architecture de la lectine elle-même qui contient au moins 2 sites de liaison aux glucides.
• Par l'hôte qui présentent les ligands glucidiques de manière multivalente ou sous forme d'amas à la surface cellulaire.

Le galactose a été greffé à différentes teneurs sur des nanoparticules (GNP-2, GNP-3 et GNP-6). Figure ci-dessous, le galactose est représenté par les hexagones noirs.

Source : Reynolds et al. (2012)

Puis on étudie la fixation de l'isoforme I de la lectine de Pseudomonas aeruginosa (PA-IL) sur ces galacto-nanoparticules par titrage calorimétrique isotherme.

Analyser les courbes ci-dessous.

A) Titrage témoin de PA-IL 0,047 mM dans la cellule de l'échantillon par injections de galactose 1,7 mM dans la seringue. Remarque : n = 1 site de fixation du galactose par monomère dans la structure cristalline de la lectine.

Titrages "inverses" des GNP par PA-IL :

• B) Titrage de GNP-2 (galactose 17 %) 0,048 mM par injections de PA-IL 0,36 mM dans la seringue.
• C) Titrage de GNP-3 (galactose 33 %) 0,031 mM par PA-IL 0,35 mM dans la seringue.
• D) Titrage de GNP-6 (galactose 100 %) 0,070 mM par PA-IL 0,24 mM dans la seringue.
• Les rapports molaires se réfèrent au nombre de sites de fixation de PA-IL par monomère de galactose.

Source : Reynolds et al. (2012)

Extraits de l'article Reynolds et al. (2012)

Page 4268 :

• "The reaction stoichiometry (n) is defined as the number of monomeric galactose units per monomeric subunit of the lectin."
• "It should be noted that the n value for monovalent 2SAc relative to the lectin was fixed to the number of binding sites observed per monomer in the crystal structure (n=1)."
• Remarque : 2SAc désigne le galactose.

Légende figure 4 - p 4269 : "Molar ratios here refer to the number of PA-IL binding sites per galactoside ligand."
Légende tableau 4 - p 4270 : "All stoichiometries refer to the number of galactosides per PA-IL binding site."

Fig A : 1/1 = 1; Fig B : 1/1,2 # 0,8; Fig C : 1/0,76 # 1,3; Fig D : 1/2,1 # 0,48

Incidence des valeurs du paramètre c

c = n.[P]₀/K_d où n est le nombre de site(s) de fixation du ligand, [P]₀ la concentration initiale de la protéine dans la cellule et K_d la constante de dissocation du ligand.

• Si 1 < c < 1000 : les 3 paramètres de la fixation peuvent être déterminés simultanément et avec précision (les isothermes peuvent être déconvolués précisément).
• Si c > 1000 : seuls ΔH_réaction et n peuvent être déterminés. L'isotherme de liaison a un point d'inflexion si c > 1.
• Si c < 1 : seul K_d peut être déterminée car ΔH_réaction et n sont corrélés.

Source : AZOM

1. Principe de l'ITC

L'ITC est une méthode qui permet de mesurer, en théorie, les valeurs quantitatives des grandeurs thermodynamiques liées à l'interaction entre molécules dans leur état natif.

• Elle mesure l'équilibre de fixation en déterminant la chaleur dégagée lors de l'association d'un ligand avec son partenaire.
• Les mesures du transfert thermique sont effectuées avec un microcalorimètre qui détecte la différence de température entre une cellule de référence et une cellule contenant l’échantillon.
• L’ITC a un temps de réponse de l’ordre de la seconde et une limite de détection de l’ordre du dixième de microcalorie.s^-1.

En une seule expérience :

• Les valeurs de la constante de dissociation (K_d), de la stoechiométrie (n) et de l'enthalpie de la réaction de fixation (ΔH_réaction) peuvent être déterminées, en théorie.
• L'énergie libre de Gibbs (ΔG) et l'entropie (ΔS) de fixation sont ensuite calculées : ΔG = - R.T Ln(K_d) et ΔG = ΔH - TΔS

2. Fonctionnement du calorimètre

Le calorimètre pour un titrage isotherme est composé de 2 cellules identiques : une cellule de référence ("Reference cell") et une cellule contenant l'échantillon (la protéine par exemple, "Sample cell"). Ces cellules sont :

• Ont le même volume effectif V₀.
• Thermiquement conductrices et chimiquement inertes (exemple : Hastelloy, alliages de nickel résistant à la corrosion).
• Entourées d'une enveloppe adiabatique ("Adiabatic shield") : il n'y a pas de transfert thermique entre les cellules et le milieu extérieur.

Source : Song et al. (2015)

Une seringue ("Stirring syringe") est insérée dans la cellule contenant la protéine :

• Une série d'injections du ligand dont on veut étudier la fixation est effectuée.
• Les volumes injectés sont très petits par rapport à V₀ afin de minimiser le plus possible la dilution de la protéine.

A chaque injection, la réaction protéine + ligand <=> [protéine-ligand] se traduit par une variation d'enthalpie (ΔH_réaction) qui s'accompagne d'un dégagement (ou d'une absorption) de chaleur ("heat").

• Le circuit [thermopile – thermocouple] du calorimètre mesure la différence de température (ΔT) entre la cellule de référence et la cellule contenant la protéine où a lieu cette réaction.
• Le circuit fournit alors la puissance de rétroaction ("Feedback power") nécessaire au maintien de la condition isotherme en augmentant (ou en diminuant) la température de la cellule contenant la protéine.

3. Acquisition des données

Au fur et à mesure que les injections du ligand s'accumulent, le rapport molaire entre le ligand et la protéine augmente et la protéine est progressivement saturée. Bien que minime, puisque les volumes injectés sont très petits, on doit cependant tenir compte de la dilution progressive de la protéine.

Source : Paketuryte et al. (2019)

Au fur et à mesure que la protéine est saturée par le ligand, l'amplitude des pics diminue car elle est proportionnelle au nombre de liaisons qui s'établissent.

• La chaleur à chaque injection est obtenue en calculant la surface de chaque pic.
• La puissance thermique P_therm (µJ.s^-1) consommée (ou libérée) à chaque injection est intégrée par rapport au temps : ΔH_réaction = ∫_t (P_therm . dt)

Source : Paketuryte et al. (2019)

Quand on a un excès de ligand par rapport à la protéine, la limite inférieure de l'amplitude des pics ne reflète plus que la dilution de la protéine et les effets mécaniques lors d'une nième injection : l'isotherme de fixation est une courbe sigmoïde (voir ci-dessous).

Le contenu thermique total dans le volume V₀ de la cellule contenant la protéine est : Q = n.[P]₀.V₀.ΔH_réaction.Θ

• n = nombre de site(s) de fixation par monomère de protéine
• [P]₀ = concentration initiale de la protéine
• Θ = fraction de sites occupés par le ligand
• Voir un développement.

4. Grandeurs déterminées à partir de l'isotherme de fixation

Soit l'équilibre de fixation d'un ligand L sur une protéine P contenant n sites de fixation :

          Kd
P + n L <=====> PLn

On peut déterminer graphiquement les différents paramètres à partir de de l’isotherme de fixation (ci-dessous) :

• ΔH_réaction : amplitude de l’isotherme de fixation (ci-dessous)
• n : valeur du rapport des concentrations molaires au centre de l’isotherme de fixation.
• K_association = 1/K_dissociation : pente de l’isotherme de fixation.

Les valeurs de c et ΔH déterminent les caractéristiques géométriques de l'isotherme de fixation :

• La déviation globale de cet isotherme (différence entre le point d'intersection avec l'axe des y et la chaleur observée à forte saturation) est égale à c / (c+1).ΔH.
• La pente de cet isotherme pour un rapport molaire = 1 est approximativement égale à -0,25 c^0,5.ΔH.

Synthèse de cette correction au format PDF (tous droits réservés biochimej).