Effet de l'ATP, du citrate et du NADH sur l'activité de la phosphofructokinase-1
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Les courbes ci-dessous représentent la vitesse de la réaction catalysée par la phosphofructokinase 1 (PFK-1) en fonction de la concentration d’ATP, du citrate et du NADH.

- Sur la base du schéma précédent, interprétez l’allure des courbes obtenues pour l’ATP et le citrate.

- Etablir un lien entre l’activité de la PFK1 et la concentration du NADH (glycolyse et cycle de Krebs).

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1. Rappels sur l'allostérie et le modèle MWC

a. L'un des moyens employés par la cellule pour contrôler le flux global d'une voie métabolique est la modulation de l'activité de certaines enzymes selon un mécanisme extrêmement sophistiqué : la régulation allostérique :

  • les effets allostériques sont les interactions indirectes entre sites de fixation distincts
  • ces interactions sont médiées par le passage d'une conformation à une autre de la structure de la macromolécule (la transition allostérique)
  • ces effets se traduisent par la fixation coopérative (voire anti-coopérative) de l'un et/ou l'autre des ligands (substrats, effecteurs) de l'enzyme.

b. Le terme allostérique vient des deux mots Grecs : "allos" et "stereos" qui signifient : "une autre forme" ou "un autre solide". Il peut donc s'entendre comme "une autre conformation".

Avec le développement de modèles décrivant les effets allostériques, il a pris un sens supplémentaire : "un autre site".

a. Deux classes d'effets allostériques sont définies :

  • effets homotropes : les interactions entre ligands identiques
  • effets hétérotropes : les interactions entre ligands différents. Ces effets traduisent une plus grande aptitude (ou au contraire moins grande) de la macromolécule à subir la transition allostérique (le passage d'une conformation à une autre)

d. Nomenclature du modèle MWC

L'enzyme étudiée par Monod, Wyman & Changeux pour établir leur modèle est la phosphofructokinase, enzyme tétramérique constituée de 4 sous-unités identiques.

Les deux états conformationnels que peut adopter un protomère sont dénommés respectivement :

  • T (pour "Tense"), conformation "tendue", les sites de fixation ont une affinité faible pour un ligand donné (S dans le schéma ci-contre)
  • R (pour "Relax"), conformation "relâchée", les sites de fixation ont une affinité forte pour un ligand donné

Ces deux conformations sont en équilibre (quelle que soit la concentration d'un ligand donné) et cet équilibre est régit par la constante allostérique L0 :

L0
T0 <=====> R0

equilibre etat T R tense relax phosphofructokinase allosterie allostery MWC activite enzyme PFK1 glycolyse citrate NADH regulation metabolisme glucose cycle Krebs metabolomique metabolomics energie energy metabolism biochimej

Visualisation de la phosphofructokinase 1 de Bacillus stearothermophilus une résolution de 2,4 Å.

Code PDB : 4PFK

Remarque : seule la chaîne A est représentée.

Pour faire apparaître de multiples fonctions du menu Jmol :

  • clic sur "Jmol" (Mac)
  • clic droit sur "Jmol" (PC)

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2. La PFK-1 joue un rôle primordial dans la régulation du flux de la glycolyse.

En effet, l'activité de cette enzyme est régulée par la concentration de ses substrats (l'ATP et le fructose 6-phosphate) mais aussi par celles de de nombreux effecteurs liés à la production d'énergie (ATP) par la phosphorylation oxydative.

Ces effecteurs sont : l'ATP lui-même, l'ADP, l'AMP, le phosphoénolpyruvate, le phosphate inorganique, le citrate, le NADH.

3. Effet de l'ATP

L'ATP est un cas particulier : c'est l'un des deux substrats de la PFK mais c'est aussi un effecteur.

En effet la PFK-1 possède :

  • un site de fixation de l'ATP en tant que substrat (effet homotrope)
  • un site de fixation en tant qu'effecteur (effet hétérotrope)

Partie gauche de la courbe de saturation

Elle reflète l'effet de l'ATP sur la vitesse de la réaction enzymatique en tant que substrat.

L'allure hyperbolique de cette première partie de la courbe indique que la fixation de l'ATP aux 4 sites catalytiques (la PFK est un homotétramère) s'effectue selon un mécanisme "Michaelien" (voir le cours).

Celà signifie qu'il n'y a pas d'effet coopératif dans la fixation des molécules d'ATP.

Courbe saturation ATP effecteur allosterique allosterie allostery MWC activite enzyme PFK1 glycolyse citrate NADH regulation metabolisme glucose cycle Krebs metabolomique metabolomics energie energy metabolism biochimej

Partie droite de la courbe de saturation :

A partir d'une certaine concentration, des molécules d'ATP se fixent sur un site qui n'est pas le site catalytique : ce site est lié à la régulation de l'activité catalytique.

C'est un site effecteur : certaines molécules d'ATP n'agissent plus comme substrat mais comme effecteur :

  • La fixation de molécules d'ATP sur ce site induit un changement de conformation de certaines molécules d'enzyme.
  • Les sites catalytiques dans cette conformation (dite "tendue" ou "tense", T) ne fixe pas ou trés mal l'ATP.
  • Dans cette conformation T, l'enzyme n'est pas ou trés peu active.

En conséquence :

Une partie des molécules d'enzyme étant inactive, la concentration réelle de complexe enzyme - substrat ([ES]) est moindre que la concentration d'enzyme.

La vitesse de catalyse diminue puisque : vi = kcat x [ES].

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4. Effet du citrate

Le lien avec la glycolyse et la PFK-1 est direct puisque le citrate est un inhibiteur de la PFK-1.

Structure citrate allosterie allostery MWC activite enzyme PFK1 glycolyse NADH regulation metabolisme glucose cycle Krebs metabolomique metabolomics energie energy metabolism biochimej

Le lien avec la glycolyse et la PFK-1 s'établit aussi via le fructose 2,6-bisphosphate (F2,6BP) formé à partir du fructose 6-phosphate par la phosphofructokinase-2 (PFK-2).

Reaction catalyse phosphofructokinase fructose 2,6-bisphosphatase PFK2 allosterie allostery MWC activite enzyme PFK1 glycolyse citrate NADH regulation metabolisme glucose cycle Krebs metabolomique metabolomics energie energy metabolism biochimej

Or le F2,6BP est un activateur de la PFK-1.

fructose 2,6-bisphosphate F26BP PFK2 kinase phosphatase allosterie allostery MWC activite enzyme PFK1 glycolyse citrate NADH regulation metabolisme glucose cycle Krebs metabolomique metabolomics energie energy metabolism biochimej

Par ailleurs, le citrate est un intermédiaire du cycle de Krebs qui est alimenté par le pyruvate, produit terminal de la glycolyse.

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Or le citrate est :

  • un inhibiteur de la PFK-1.
  • un inhibiteur de la PFK-2 : il y a donc moins de F2,6BP synthétisé.

Comme le F2,6BP est un activateur de la PFK-1, celà amplifie l'effet inhibiteur de la PFK-1 par le citrate.

PFK1 allosterie allostery MWC activite enzyme glycolyse citrate NADH regulation metabolisme glucose cycle Krebs metabolomique metabolomics energie energy metabolism biochimej

5. Effet du NADH

Au cours de la glycolyse, le NADH est produit par la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase.

Une concentration élevée de NADH signifie une forte synthèse d'ATP (donc une glycolyse et un cycle de Krebs intenses) et en conséquence, un niveau énergétique de la cellule élevé.

Il est inutile pour la cellule d'augmenter ce niveau énergétique.

NADH NADPH allosterie allostery MWC activite enzyme PFK1 glycolyse citrate regulation metabolisme glucose cycle Krebs metabolomique metabolomics energie energy metabolism biochimej

A forte concentration, le NADH inhibe l'activité de la PFK-1.

La PFK-1 est moins active tant qu'il n'y a pas suffisamment de NAD réoxydé.

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Entrée dans la mitochondrie du pouvoir réducteur porté par le NADH formé au cours de la glycolyse (dans le cytoplasme) - cycle de Krebs

 

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