Voir la thématique générale.

Voir un cours sur les rayonnements ionisants et radioactivité.

Voir un cours sur les effets biologiques des rayonnements ionisants

a. Développement des plages de lyse et choix des étalements à cribler

En regard du nombre d'échantillons et du nombre de rapport [bras:ADNc], nous nous sommes focalisés sur Pisum sativum.

Les bactéries E. coli LE 392 en phase exponentielle de croissance ont été transformées par les milieux d'empaquetage obtenus avec Pisum sativum (imbition 12 h et 22 h) pour les 2 rapports [bras:ADNc] (1:1 et 3:1). Les milieux d'empaquetage ont été utilisés non dilués afin d'obtenir environ 15 000 à 30 000 plages de lyse par boîte, dans le but d'augmenter la probabilité qu'il y ait un clone d'intérêt, en l'occurrence un phage recombinant contenant la séquence codant la GDH EC 1.4.1.4.

Les bactéries transformées ont été étalées sur de grandes boîtes carrées (12 cm²). Après développement des plages de lyse (une nuit à 37°C), les 4 boîtes les plus denses en plages de lyse ont été retenues :

• imbibition 12 h : 2 boîtes pour le rapport [bras:ADNc] 1:1 et 1 boîte pour le rapport 3:1 ;
• imbibition 22 h : 1 boîte pour le rapport [bras:ADNc] 1:1.

b. Préparation des membranes et empreintes des étalements

Les hybridations ont été faites avec des membranes de Nylon non chargées ("GeneScreen®", NEN) :

• Elles ont été imbibées d'eau et autoclavées dans du papier Whatman®.
• Elles ont été mises au contact des plages de lyse pendant 15 min (chaque boîte et chaque membrane ont été soigneusement annotées afin de connaître l'orientation des membranes par rapport aux plages de lyse).

Les membranes ont ensuite été traitées de la manière suivante :

• NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M pendant 10 min afin de dénaturer l'ADN double brin
• NaCl 1,5 M, Tris 0,5 M pendant 10 min afin de neutraliser la solution de soude
• SSPE 5 X (NaCl 0,9 M ; NaH2PO4 50 mM ; EDTA 5 mM, pH 7,7) pendant 10 min (2^ème bain de neutralisation)

Les membranes ont été séchées sur papier Whatman® pendant 2 heures à température ambiante et elles ont été exposées aux ultra-violets pendant 3 min pour fixer l'ADN sur le Nylon.

c. Préparation des sondes radioactives

Bien que le choix ait été fait de cribler les banques de Pisum sativum, les produits d'amplification par PCR obtenus à partir des 4 échantillons (Pisum sativum imbibition 12 h et 22 h ; Medicago truncatula imbibition 10 h et 30 h) avec le couple d'amorces dégénérées GDH (voir la partie "Synthèse du second brin") ont été utilisés pour la préparation de 4 sondes radioactives, augmentant ainsi la probabilité qu'une séquence spécifique de la GDH EC 1.4.1.4 ait été "sélectionnée".

Environ 30 ng d'ADNc de produits d'amplification ont été dénaturés (100°C, 10 min) puis immédiatement placés dans la glace afin d'éviter leur renaturation.

Chaque brin d'ADN a servi de matrice pour la synthèse du brin complémentaire marqué au ³²P. Cette synthèse a été effectuée pendant une heure à 37°C dans un milieu réactionnel contenant :

• 3 µL d'un mélange équimolaire de dATP, dGTP et dTTP
• 5 µL (50 µCi) de dCTP marqué au ³²P en position a
• 2 µL d'un mélange d'amorces (hexanucléotides de séquence aléatoire)
• 1 µL d'ADN polymérase I (fragment Klenow)
• 8 µL d'eau.

Les nucléotides non incorporés ont été éliminés par chromatographie sur gel de filtration (Sephadex® G50).

d. Préhybridation des membranes, hybridation avec les sondes radioactives et lavages

Chaque membrane (enroulée dans un drain) a été placée dans un tube à hybridation contenant 5ml de solution de préhybridation (SSPE 5 X, Denhardt's, SDS 0,5 %).

La solution Denhardt's permet de minimiser la fixation non spécifique de la sonde radioactive en saturant les sites du Nylon non occupés par l'ADN. Les tubes ont été mis en rotation pendant une heure à 65°C dans un four à hybridation (Hybaid).

La solution de préhybridation est remplacée par 3ml de solution d'hybridation (SSPE 5 X, SDS 0,5 %) contenant la sonde radioactive préalablement dénaturée à 95°C. L'hybridation se fait pendant 12 heures à 65°C.

Les lavages ont été effectués dans des conditions de plus en plus stringentes (diminution de la concentration en sel et augmentation de la température) afin d'éliminer l'excès de sonde et les hybrides non spécifiques :

• solution de SSPE 2 X, SDS 0,1% - 10 min à température ambiante (2 lavages)
• solution SSPE 1 X, SDS 0,1% - 15 min à 65°C
• solution de SSPE 0,1 X, SDS 0,1 % - 10 min à 65°C

e. Autoradiographie

Après séchage, les membranes ont été scellées sous plastique puis placées dans des cassettes en plomb au contact d'un écran au phosphore intensificateur de signal ("Imaging Screen K®", Kodak) pendant 3 jours.

La révélation a été faite avec un phospho-imageur ("Molecular Imager FX®", BioRad).