Resultats Extraction ARN totaux Construction banque ADNc graine Pisum sativum Medicago truncatula germination biochimej

Construction de banques d'ADNc de semences de Pisum sativum et de Medicago truncatula

Extraction des ARN totaux

Pour chacun des 2 temps d’imbibition (12 h et 22 h), les ARN totaux ont été extraits à partir de 4 g de graines entières de Pisum sativum. Ceux de Medicago truncatula ont été fournis par une équipe de l'ex-UMR PMS.

a. Mesures d'absorbance

La concentration des ARN totaux et l'éventuelle contamination par d'autres types de macromolécules sont déterminées en mesurant l'absorbance à trois longueurs d'onde :

260 nm (253 nm < λ_max < 271 nm) : longueur d'onde moyenne d'absorbance maximale des ribonucléotides 5'-monophosphate. La concentration des acides nucléiques est calculée à partir de la relation : 1 unité d'absorbance à 260 nm = 40 µg/mL
277 nm : contamination par les protéines à pH 7 (λ_max du noyau indole des Trp) et les polyphénols
230 nm : contamination par les polysaccharides

Matériel biologique	imbibition	concentration ARN totaux			contaminations
Matériel biologique	imbibition	volume (µL)	A₂₆₀	concentration (µg/mL)	A₂₇₇	A₂₆₀/A₂₇₇	A₂₃₀	A₂₆₀/A₂₃₀
Pisum sativum	12 h	2000	0,239	976	0,114	2	0,121	1,97
Pisum sativum	22 h	2000	0,129	528	0,063	2,04	0,074	1,74
Medicago truncatula	10 h	500	0,136	270	0,091	1,49	0,075	1,81
Medicago truncatula	30 h	500	0,281	556	0,186	1,51	0,152	1,84

Les valeurs indiquent une faible contamination par les protéines / polyphénol pour Pisum sativum et une faible contamination par les polysaccharides pour tous les échantillons (sauf Pisum sativum 22h).

Spectre d'absorbance des ARN totaux de Pisum sativum imbibition 12 h :

glutamate dehydrogenase vecteur clonage phage lambda gt11 extraction purification ARN totaux synthese premier second brin ADNc insert encapsidation recombinant transfection coli LE392 criblage titre banque sonde radioactive biochimej

Spectre d'absorbance des ARN totaux de Pisum sativum imbibition 22 h :

b. Gels d'électrophorèse (agarose 1%) en conditions dénaturantes

A : imbibition 22 heures - 4 µg; B : imbibition 12 heures - 8 µg

A : axes embryonnaires imbibés 10 heures; B : cotylédons imbibés 10 heures
C : axes embryonnaires imbibés 30 heures; D : cotylédons imbibés 30 heures

c. Comparaison avec des ARN totaux qualité commerciale

Le gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes révèle des ARN totaux (puits 1) peu dégradés : on voit une bande de faible intensité en bas du gel pouvant correspondre à de très courts fragments issus d'une hydrolyse partielle par des RNases. De plus, il n'y a pas de contamination visible par de l'ADN génomique.

Source : Clontech

M : marqueurs de masse molaire / 1 : ARN totaux de placenta humain
Les deux bandes les plus intenses (environ 1,9 kb et 4,5 kb) correspondent respectivement aux ARN ribosomiques 18S et 28S.