1. Introduction

2. La chromatographie d'échange d'ions

3. Les différents types d'échangeurs d'ions

4. Remarque préliminaire sur la chromatographie d'exclusion ou filtration sur gel

5. Principe de la chromatographie d'exclusion ou filtration sur gel

6. Détermination de la masse molaire d'une moléculepar filtration sur gel

7. Expérience à analyser

Voir un cours plus complet sur la chromatographie

1. Introduction

a. La chromatographie est une technique d'analyse pour séparer les constituants d'un mélange.

• Les molécules à séparer sont entraînées par un fluide (un liquide ou un gaz) que l'on appelle la phase mobile.
• Elles interagissent ou au contraire n'interagissent pas avec un support (ou matrice) fixe (un solide ou un liquide fixé) que l'on appelle la phase stationnaire : il y a donc une distribution ou partition des composants entre ces deux types de phase.
• Le flux du fluide vecteur étant continu, c'est la rétention plus ou moins longue des différentes molécules sur le support fixe, qui va les séparer les unes des autres.

b. Si un type de chromatographie repose sur une caractéristique physico-chimique donnée, la séparation peut être influencée de manière "secondaire" par d'autres caractéristiques.

Par exemple :

• Un échangeur d'ions comportant un groupement hydrophobe, comme le noyau phényl du "DOWEX", interagit aussi par interactions hydrophobes : ainsi pour 2 acides aminés de charge identique, l'hydrophobicité de la chaîne latérale influencera en second lieu la séparation de ces molécules.
• Un gel de filtration "Sephadex" peut être utilisé comme gel d'affinité pour les protéines qui fixent les dérivés du glucose tel que le dextran.

c. Le support ou matrice utilisé pour constituer la phase stationnaire s'appelle un gel de résine. Ce gel se présente souvent sous la forme de billes (sphériques ou, plus rarement, de forme irrégulière). Ces billes sont elles mêmes des polymères de différents types de molécules.

Par exemple, de styrène - divinylbenzène pour certaines résines d'échange d'ions ou de polyholosides pour les gels de filtration.

2. La chromatographie d'échange d'ions

a. Choix du type d'échangeur d'ions en fonction du pI de la protéine à séparer et du pH du tampon

Considérons une protéine de pI = 5.

• 1er cas : si le pH du tampon utilisé pour la chromatographie est inférieur au pI de la protéine (zone bleue), celle-ci est chargée positivement. Il faut utiliser un échangeur de cations.
• 2ème cas : si le pH du tampon utilisé pour la chromatographie est supérieur au pI de la protéine (zone rouge), celle-ci est chargée négativement. Il faut utiliser un échangeur d'anions.

Variation de la charge nette d'une protéine en fonction du pH.

b. Fixation au gel

Dans un premier temps, la résine est équilibrée dans un tampon dont le pH est tel que le groupement porté par l'échangeur d'ions soit ionisé :

• Dans le cas d'une base (échangeur d'anions), le pH doit être inférieur au pK_a du groupement ionisable (exemple : le pK_a du groupement diéthylaminoéthylammonium est 9,5).
• Dans le cas d'un acide (échangeur de cations), le pH doit être supérieur au pK_a du groupement ionisable (exemple : le pK_a du groupement carboxyméthyl est 4).

• négative : le pI de l'albumine de sérum bovin est 4,9, cette protéine est chargée négativement à pH 7
• nulle
• positive : le pI du cytochrome c est 10,7, cette protéine est chargée positivement à pH 7

c. Elution des molécules fixées au gel

Il y a deux manières pour éluer les molécules fixées sur la résine :

• En ajoutant un sel (à une concentration croissante) qui apporte forcément un ion de même charge que les molécules fixées à la résine : cet ion s'appelle un contre - ion.
• En modifiant le pH de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui sont chargées ne le soient plus (ou qu'elles portent une charge de même signe que l'échangeur d'ions). Il n'y a plus d'interaction électrostatique entre les molécules et le groupement chargé porté par la résine et les molécules sont éluées. Attention : cette méthode peut induire une dénaturation des molécules biologiques (en particulier les protéines) si les pH sont extrêmes.

3. Les différents types d'échangeurs d'ions

Les échangeurs d'ions sont des billes qui portent des groupements ionisables dont la charge est :

4. Remarque préliminaire sur la chromatographie d'exclusion ou filtration sur gel

Le principe de la chromatographie d'exclusion (appelée aussi filtration sur gel ou tamisage moléculaire ou chromatographie de perméation) repose en première approximation sur la masse molaire des molécules à séparer.

En toute rigueur, le paramètre physico-chimique qui intervient est la dimension des molécules, donc leur volume et donc plus précisément leur rayon de Stokes. Mais cette relation univoque [masse molaire - rayon de Stokes] n'est valable que pour des protéines dites "globulaires", c'est-à-dire assimilées à des sphères.

Différents paramètres influencent le volume des molécules et peuvent fausser la détermination de la masse molaire réelle par ce type de chromatographie :

• La géométrie : pour une même masse molaire, une protéine "allongée" (exemple, la calmoduline) n'aura pas les mêmes dimensions qu'une protéine globulaire.
• Les modifications post-traductionnelles : par exemple, les longues chaînes d'oses modifient fortement la géomètrie des protéines glycosylées et les rend plus denses ; à l'inverse, les lipoprotéines sont "allégées" par la présence de lipides.
• La présence de sels, d'agents chaotropiques, de détergents...

C'est l'une des techniques de chromatographie les plus difficiles à maîtriser techniquement.

5. Principe de la chromatographie d'exclusion ou filtration sur gel

La phase stationnaire est constituée de billes de polysaccharides (du type "Sephadex" ou du type "Sepharose" qui est de l'agarose) gonflées dans le solvant utilisé pour l'élution :

• Le volume des billes est très finement calibré.
• Ainsi les molécules dont le volume est supérieur à celui des billes ne peuvent y pénétrer et sont éluées rapidement.
• En revanche, les molécules dont le volume est inférieur à celui des billes y pénétrent et y subissent des frottements qui les retardent.

La série des gels "Sephadex" (G-25, G-50, G-75, ...) est très largement employée en chromatographie de filtration sur gel. Les indices G-25, G-50, G-75, ... indiquent la granulométrie des billes du gel, c'est-à-dire leur volume.

Les billes de "Sephadex" sont constituées d'un dérivé du dextran (figure ci-dessous) : ce sont des chaînes de glucose liées par des liaisons osidiques 1-> 4 et 1->6.

Le type de gel est choisi en fonction du domaine de fractionnement dans lequel se trouvent les molécules à séparer. Par exemple, la figure ci-dessous indique que le gel le mieux adapté pour la séparation de protéines ou d'oligonucléotides de masse molaire (M. M.) : 2000 Da < M. M. < 70000 Da est le gel de filtration "Superdex 75".

• Les molécules de M. M. inférieures à 2000 Da sont totalement retardées (à la limite, elles ne sortent pas du gel dans le temps maximal imparti à l'élution totale).
• Les molécules de M. M. supérieures à 70000 Da sont exclues du gel et sont éluées dans le volume d'exclusion.

Source : Gels pour chromatographie de filtration sur gel, Pharmacia

6. Détermination de la masse molaire d'une molécule par filtration sur gel

1. Un mélange de molécules, que l'on appelle standards, de masse molaire connue est séparé par chromatographie de filtration sur gel (pics d'élution 1 à 7, figure ci-dessous).

2. Chaque molécule (caractérisée par un pic d'absorbance, par exemple) a un volume d'élution V_e.

3. Le volume d'exclusion du gel (V₀) est le volume d'élution d'une molécule non retardée, c'est-à-dire une molécule de taille supérieure à celle des billes et qui n'y diffuse pas. Bien souvent, on utilise le bleu dextran, polymère d'ose de masse molaire supérieure à 2 10⁶ Da.

4. Le volume total du gel (V_t) est la somme du volume des billes et du volume externe aux billes. Il est donné par le volume d'élution d'une molécule qui diffuse totalement dans les billes (donc totalement retardée), ici la ruonosine.

Source : Chromatographie (Waters)

5. A partir du profil d'élution des standards, on trace la la droite étalon : V_e/ V₀= f log (masse molaire).

6. Dans les mêmes conditions de chromatographie que pour le mélange des standards, on détermine le volume d'élution d'une molécule inconnue.

7. On reporte la valeur du rapport V_e/ V₀ de la molécule inconnue sur la droite étalon et ainsi on détermine sa masse molaire.

7. Expérience à analyser

Le gel de chromatographie Superdex G200 a été calibré avec les protéines standard suivantes : thyroglobuline (669 kDa) , ferritine (440 kDa) , catalase (232 kDa) , lactate déshydrogénase (140 kDa) , albumine (66 kDa). Bleu Dextran : volume mort V₀ = 15 mL.

Le profil d'élution est présenté dans la figure ci-dessous.

1. De quels matériels, produits et consommables a-t-on besoin pour faire cette expérience ?
2. De quel type de chromatographie s'agit-il ?
3. Quel est le domaine de fractionnement du gel Superdex G200 ?
4. Pourquoi la thyroglobuline est-elle éluée avec le Bleu Dextran ?
5. Quelle technique est utilisée pour suivre l'élution des protéines ? Pourquoi ?
6. Déterminer la masse molaire d'une protéine inconnue dont le profil d'élution obtenu dans les mêmes conditions est présenté dans la figure ci-dessous.