LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE
Exercice N°1

Une protéine a été digérée par la protéase V8 qui hydrolyse spécifiquement la liaison peptidique après l'acide aminé Glu. Parmi les produits de digestions majeurs, deux ont été détectés après séparation par chromatographie de filtration sur gel : VOIR LA FIGURE

1. Quel domaine de fractionnement caractérise le gel utilisé ?
2. Calculez la masse molaire de chacun des fragments.
3. La protéine est constituée de 65 acides aminés. Si l'on considère une masse molaire moyenne de 140 Da pour chaque acide aminé, à quelle position dans la séquence primaire se situe le site de digestion ?
 

Exercice N°2

Un mélange d'acide aminé contient : Asp (D), Gly (G), Thr (T), Leu (L) et Lys (K).
On sépare ce mélange par chromatographie d'échange de cations sur DOWEX-50. Le groupement fonctionnel de ce gel est : [-R-benzène- SO3-]. Les acides aminés interagissent avec le Dowex essentiellement par interaction électrostatique mais aussi (dans une moindre mesure) par interaction hydrophobe entre la chaîne latérale et le groupement benzène porté par le gel.

Par ailleurs, une estimation de la charge portée par une molécule ionisable à un pH donné est : Dp = pI - pH

où : pI est le point isoéléctrique, c'est-à-dire le pH où la charge nette de la molécule est nulle.

Quel est l'ordre d'élution des acides aminés de ce mélange quand on fait passer sur le gel un tampon citrate de pH 3 ?
 
Acide aminé 
pI 
2,98 
5,97 
5,98 
6,53 
9,74 
M. M. 
133,1 
75,1 
131,2 
119,1 
146,2 
Hydrophobie*
- 3,5 
- 0,4 
3,8 
- 0,7 
- 4,5 

*Selon l'échelle d'hydrophobie de Kyte et Doolittle : plus la valeur est élevée, plus la molécule est hydrophobe.
 

Exercice N°3

La séquence en position C-terminale d'une protéine est obtenue par action de la carboxypeptidase Y :

  • on prélève une fraction aliquote du milieu réactionnel à différents temps d'action de l'enzyme
  • l'échantillon est traité par l'isothiocyanate de phényle (PITC) (voir le cours qui traite de la dérivation des acides aminés)
  • on sépare le phénylthiohydantoïne acide aminé (PTH - acide aminé) libéré par l'action de l'enzyme par chromatographie en phase reverse
  • on trace la cinétique de libération des acides aminés : VOIR LA FIGURE

Commentez les techniques utilisées et déterminez la séquence C-terminale de cette protéine.

 

Exercice N°4

La calmoduline est une protéine ubiquitaire qui joue un rôle prépondérant chez tous les organismes dans la transduction du signal calcique :

  • cette protéine peut fixer 4 atomes de calcium ;
  • lors de cette fixation, la calmoduline change de conformation ;
  • quand elle a adopté cette nouvelle conformation, elle se fixe sur des enzymes cibles ;
  • ces enzymes subissent à leur tour un changement de structure qui les rend actives.

La NAD - kinase est l'une des enzymes cibles de la calmoduline. La réaction catalysée par cette enzyme est : NAD + ATP <===> NADP + ADP

On a essayé de purifier cette enzyme à partir de deux types de matériau d'origine végétale par diverses méthodes chromatographiques dont voici les résultats :

1. Matériel : Lycopersicon esculentum (tomate)

 

2. Matériel : Pisum sativum (Pois)

Analyser chacun des graphiques :

  • rappeler le principe de chaque type de chromatographie ;
  • quelles fractions vous semblent les plus intéressantes à retenir ?
  • quel(s) type(s) de chromatographie vous semble le mieux adapté à la purification de la NAD kinase ?