Séparation d'acides aminés
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1. Un mélange des acides aminés suivants est soumis à une électrophorèse sur papier à pH 3,9 : A, S, F, L, R, D, H. Quels acides aminés migrent vers l’anode ? Quels acides aminés migrent vers la cathode ?

2. Pourquoi les acides aminés de même charge se séparent-ils très légèrement au cours de l’électrophorèse (exemple : Gly vs. Leu) ?

3. Soit le mélange des acides aminés A, V, E, K, T à pH 6. Quel est le profil de migration après une électrophorèse sur papier ? Indiquez l’endroit du dépôt, l’anode, la cathode et les acides aminés éventuellement non séparés. Quel produit permet de révéler les acides aminés ?

 

L'électrophorèse a pour but de séparer des molécules chargées au travers d'un gel (un polymère) sous l'effet d'un champ électrique.

Les molécules se déplacent vers le pôle de charge opposée à leur charge nette z, à une vitesse v proportionnelle à cette charge : v = E. z / f

  • E est la force du champ éléctrique
  • f est la force de friction

La séparation électrophorètique se fait donc en fonction du rapport [charge / masse].

La mobilité électrophorétique d'une molécule peut-être exprimée (de manière simplifiée) par la relation : mobilité = k . (pH - pI) / masse molaire

pI est le point isoélectrique de la molécule.

Considérons une protéine de pI = 5 :

  • si le pH du tampon utilisé pour la chromatographie est inférieur au pI de la protéine (zone bleue), celle-ci est chargée positivement : il faut utiliser un échangeur de cations
  • si le pH du tampon utilisé pour la chromatographie est supérieur au pI de la protéine (zone rouge), celle-ci est chargée négativement : il faut utiliser un échangeur d'anions.

amino acid isoelectric point separation migration electrophoresis biochimej

L'électrophorèse permet, entre autre, de :

  • déterminer le nombre de sous-unités d'une protéine et de déterminer leur masse molaire respective
  • d'évaluer le degré de purification d'une protéine
  • de séparer des protéines pour les révéler par la technique du Western blot (réaction avec un ou des anticorps)
  • de séparer des protéines sur des gels bi-dimensionnels (technique de départ en protéomique), selon 2 paramètres : point isoélectrique (isoélectrofocalisation - IEF) puis masse molaire
  • ...
  • de séquencer l'ADN
  • de déterminer la taille de fragments d'ADN
  • de séparer des acides nucléiques pour les analyser par la technique du Northen blot (ARN) ou du Southern blot (ADN)
  • d'établir le profil de restriction (hydrolyse par des enzymes de restriction) de fragments d'ADN
  • ...

Question 1. Dans le cas du mélange d'acides aminés (A, S, F, L, R, D, H. ) soumis à une électrophorèse sur papier à pH 3,9 :
Acide aminé pI charge à pH 3,9 sens migration
A 6 + cathode
S 5,7 + cathode
F 5,5 + cathode
L 6 + cathode
R 10,8 +++ cathode
D 2,9 - anode
H 7,6 ++ cathode
Remarque : selon les sources, on peut avoir des valeurs de pI ou de pKa qui diffèrent légèrement.

Question 2. La séparation électrophorètique se fait en fonction du rapport charge / masse.

Gly migre donc davantage que Leu car même s'ils ont la même charge, Gly a une chaîne latérale moins volumineuse, donc une masse plus faible (Gly : 57.02 / Leu : 113.08).


Question 3. Profil de séparation électrophorètique du mélange : A, V, E, K, T à pH 6.
Acide aminé pI charge à pH 6 sens migration
A 6 neutre ne migre pas
V 6 neutre ne migre pas
E 3,2 négatif anode
K 9,6 positif cathode
T 5,6 légèrement négatif légère migration anode

La ninhydrine permet de révéler les acides aminés.

Le pourpre de Ruhemann (λ = 570 nm) est la couleur caractéristique du produit de réaction des acides aminés colorés à la ninhydrine.

Exception faite de la proline et de l'hydroxyproline qui sont colorées en jaune (λ = 440 nm).

ninhydrine amino acid isoelectric point separation migration electrophoresis biochimej


Nature et caractéristiques des chaînes latérales
Acide aminé code Nature de la chaîne latérale Caractéristiques pKa ionisation
alanine (Ala) A

aliphatique (hydrocarbure saturé)

Ala : groupe méthyle
Val, Leu & Ile : chaîne ramifiée

Ile contient 2 carbones
asymétriques (4 stéréoisomères)
---------
valine (Val) V
leucine (Leu) L
isoleucine (Ile) I
proline (Pro) P

acide α-Iminé (groupe aminé secondaire) chaîne latérale liée à la fois au groupe α-carboxyle ET au groupe α-aminé

structure particulière qui impose des changements de direction de l'enchaînement des carbones α des chaines polypeptidiques

---------
phénylalanine (Phe) F groupe aromatique
Phe : groupe phényl
Trp : noyau indole
Tyr : groupe phénol
absorbent la lumière UV (ce qui permet de mesurer la concentration d'une protéine en solution)
Phe : λ = 260 nm / Trp : λ = 278 nm
Tyr à pH 7 : λ = 273 - 277 nm
Tyr à pH 13 (ion phénolate) : λ = 293 - 297 nm
---------
tryptophane (Trp) W ---------
tyrosine (Tyr) Y 10,5
méthionine (Met) M groupe méthylthioester Met et Cys sont des mercaptans ---------
cystéine (Cys) C groupe thiol peut former un pont disulfure avec une autre cystéine 8,4
glycine (Gly) G atome d'hydrogène seul acide aminé non chiral et le plus petit ---------
aspartate (Asp) D groupe carboxyle

souvent à la surface des protéines où ils établissent des liaisons hydrogène ou des ponts salins (solvant ou autres molécules)

3,9
glutamate (Glu) E 4,1
asparagine (Asn) N amides respective
de Asp et Glu
trés polaires
souvent à la surface des protéines (liaisons hydrogène)
---------
glutamine (Gln) Q ---------
sérine (Ser) S

alcool aliphatique

groupe β - hydroxyle

réactif au sein des protéines, exemple : protéases à sérine non mesurable en solution aqueuse
thréonine (Thr) T 2 carbones asymétriques (4 stéréoisomères) ---------
lysine (Lys) K bases azotées
Lys : groupe ε - aminé
Arg : ion guanidinium
His : noyau imidazole

souvent à la surface des protéines où ils établissent des liaisons hydrogène ou des ponts salins (solvant ou autres molécules

10,5
arginine (Arg) R 12
histidine (His) H réactif au sein des protéines, exemple :
protéases à sérine (catalyse acide base)
6,0
Voir le cours sur le métabolisme des acides aminés

Liens Internet
"Les propriétés acido-basiques des acides aminés" - Université Pierre et Marie Curie Aller au site
"Proteins, Peptides & Amino Acids" / Superbe site (bien au delà des acides aminés et protéines - chimie générale, organique, ...) Aller au site
"The Titration Behavior of Amino Acids" Aller au site

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