Les ARN totaux des échantillons de Pisum sativum ont été extraits (voir un shéma du protocole). Ceux de Medicago truncatula ont été gracieusement fournis (ex-UMR PMS).
a. Extrait brut : pour chacun des 2 temps d'imbibition (12 h et 22 h), 4 g de graines de pois ont été broyés dans 16 ml de tampon d'extraction : LiCl 0,1 M ; Tris 0,5 M ; EDTA 0,5 M ; SDS 1 %.
b. Élimination des protéines et polyphénols
- L'extrait brut est réparti dans 2 tubes contenant 8 ml de tampon d'extraction et 16 ml de phénol (préalablement chauffés à 80°C).
- Après vortexage, le mélange est réparti dans 3 tubes (21 ml par tube) et 10 ml de mélange chloroforme:alcool isoamylique (24:1) sont ajoutés.
- Après vortexage et centrifugation (10000 g, 6 min à 4°C), trois phases apparaissent : les ARN totaux se situent dans la phase aqueuse (supérieure), les protéines se trouvent essentiellement dans la phase organique et l'ADN génomique constitue un anneau filamenteux à l'interphase (du fait des histones).
- Une deuxième extraction des protéines contaminantes de la phase aqueuse récupérée est effectuée avec un volume équivalent de phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1) suivie d'une centrifugation dans les mêmes conditions que précédemment.
c. Élimination des polysaccharides : la phase aqueuse est récupérée à laquelle on ajoute de l'éthanol (concentration finale 20 %) puis le mélange est centrifugé (10000 g, 4°C, 10 min).
d. Précipitation sélective des ARN : le surnageant est récupéré auquel on ajoute du LiCl (concentration finale 2 M). Les ARN totaux précipitent toute la nuit à 4°C et sont centrifugés 30 min à 10000 g à 4°C.
e. Lavages
- Le culot contenant les ARN totaux est repris dans l'eau - DEPC (diéthyl pyrocarbonate, inhibiteur des RNases). Ils sont de nouveau précipités par addition de 2 volumes d'éthanol 95% (celui-ci diminue la polarité du milieu) et de 0,1 volume d'acétate de sodium 3M (qui abaisse le pH du milieu) et centrifugés (20 min à 15000 g).
- Les ARN totaux sont remis en suspension dans l'eau - DEPC, puis lavés à l'éthanol 70 %, puis centrifugés (20 min à 15000 g) et le culot est séché.
- Enfin, les ARN totaux purifiés sont remis en suspension dans du Tris 10 mM, EDTA 1 mM.
f. Caractérisation des ARN totaux
La concentration des ARN totaux et l'éventuelle contamination par d'autres types de macromolécules sont déterminées par la valeur des rapports d'absorbance à trois longueurs d'onde : 230 nm = polysaccharides; 260 nm = acides nucléiques; 280 nm = protéines.
Les ARN adoptent des structures secondaires qui ont une incidence sur leur migration électrophorétique. Afin de pouvoir comparer la migration de tous les types d'ARN, il faut les linéariser et donc rompre les liaisons hydrogène entre les bases. En conséquence, l'intégrité des ARN totaux est vérifiée par un gel d'électrophorèse (agarose 1%) en conditions dénaturantes .
- Gel : l'agarose est dissous dans une solution de MOPS (acide 3-morpholino 1-propane sulfonique) 20 mM pH 7, acétate Na 8 mM, EDTA 5 mM, formaldéhyde 2,2 M
- Tampon de migration : MOPS 20 mM pH 7, acétate Na 8 mM, EDTA 5 mM
- Traitement des ARN totaux : ils sont dénaturés 15 min à 65°C en présence de formaldéhyde 2,2 M et de formamide 50 %
