Exercice N°1

1. Associer chaque puissance de 10 à un symbole du Système International d'Unités :

• Puissance de 10 : 100 L / 10^-3 L / 10^-6 L / 10^-9 L / 10^-12 L / 10^-15 L / 10^-18 L / 10^-21 L
• Symbole : aL / fL / µL / L / mL / zL / pL / nL

2. Ordre de grandeur : des liaisons inter-atomiques ; du temps d'excitation d'un électron d'une protéine ; du temps d'émission de fluorescence ; d'une constante de vitesse d'association (ou de dissociation) ; d'une constante de dissociation.

Voir une figure et un tableau de valeurs (excitation, fluorescence, ...).

Quelques valeurs extraites de la littérature :

• Constante de désintégration du 1er état d'excitation K de la protéorhodopsine : 2 - 20 psec
• Temps de demi-décroissance de la fluorescence après un flash laser du photosystème II de Spinacia oleracea : 200 to 400 μsec.
• Le composant a un temps de décroissance d'environ 350 ps (0,35 ns).

Exercice N°2

1. Convertir 1 µm³ en pL. Convertir 1 pL en µm^-6.

• 1 µm³ = 10^-3 pL (1 fL)
• 1 pL = 10³ µm³
• Voir un site de conversion de grandeurs.

2. Soit une cellule d'un volume de 10³ µm³ avec une concentration totale de protéines = 5 µM :

• Combien de molécules de protéines y a-t-il dans cette cellule ?
• Combien de molécules de protéines d'un type donné y a-t-il si l'on considère qu'il y a 10.000 types différents de protéines dans cette cellule ?
• Le nombre d'Avogadro (N) est le nombre d'atomes ou de molécules dans une mole de matière = 6,022 10²³ mol^-1.

Exercice N°3

1. Quel est le nom complet des méthodes d'études des interactions protéine-protéine dont les abréviations suivent : CG-MALS; AUC; SEC-MALS; BLI; CE; SPR; ITC ?

• CG-MALS : "Composition-gradient multi-angle light scattering"; AUC : "Analytical ultracentrifugation"
• SEC-MALS : "Size-exclusion chromatography multi-angle light scattering"; BLI : "Bio-layer interferometry"; CE : "Capillary electrophoresis"
• SPR : "Surface Plasmon Resonance" ; ITC : "Isothermal titration calorimetry"

Quels sont leurs points communs et leur intérêt ?

Ce sont des méthodes optiques qui ne nécessitent aucun marquage (sans étiquette) : travail simplifié et aucune perturbation induites par le marquage.

Elles sont classées en 3 catégories : basées sur la surface, basées sur la séparation et basées sur une solution.

• Chaque rayon du diagramme représente une méthode et il est divisé selon divers critères :
  • méthode sans immobilisation
  • méthode qui permet de mesurer l'affinité de fixation, la cinétique de fixation ou la stoechiométrie de fixation
  • méthode qui nécessite une quantité < 1 pmole d'échantillon
  • méthode qui permet de mesurer des interactions protéine-protéine entre molécules de faibles masses molaires.

• Le code couleur indique dans quelle mesure une méthode répond à un critère : vert = adapté; jaune = possible; orange = difficile.

Source : Soltermann et al. (2021)

2. Illustrer 2 processus cellulaires contrôlés par des interactions protéine-protéine (en mentionnant quelques exemples) et se déroulant dans des organites distincts.

• Il est important de tenir compte de l'annotation, en particulier les termes "Cellular Components" (exemple de base de données : The Gene Ontology Resource) afin de localiser les protéines impliquées dans les interactions protéine-protéine spécifiques de tel ou tel organite.

• Les données de protéomique spécifiques de chaque organite complètent les informations.

• Les informations issues des voies métaboliques fournies par des bases de données telles que KEGG sont également capitales pour établir un panorama complet.

Illustration : les protéines multilocalisées jouent un rôle important dans les réseaux d'interactions protéine-protéine chez Arabidopsis thaliana.

• Pour comprendre comment les protéines interagissent et décrire les réseaux de régulation entre elles, 4548 paires de protéines en interaction ont été utilisées pour construire les interactomes (réseaux d'interactions) avec le programme de visualisation de réseaux Cytoscape.
• Résultat : voir la figure 1 de Xiong et al. (2022) "Multilocation proteins in organelle communication: Based on protein–protein interactions" Plant Direct 6, e386

Exercice N°4

Interpréter l'enregistrement ci-dessous (nom de la technique, différentes phases, données obtenues, …).

Il s'agit d'un sensorgramme de résonance de plasmons de surface ("Surface Plasmon Resonance" - SPR) : c'est une méthode optique qui mesure l'indice de réfraction à la surface d'un biocapteur.

Une protéine est immobilisée sur une surface métallique (le biocapteur) et une solution du ligand est injectée sur cette surface.

• La fixation du ligand modifie l'indice de réfraction de la surface du biocapteur en raison de la variation de masse lors de la formation du complexe [protéine immobilisée - ligand] : cela se traduit par une augmentation du signal exprimé en unité de résonance ou de réponse ("Resonance or response Unit" - RU).
• A l'inverse, la dissociation du complexe entraîne une diminution de la valeur RU.

• A t = 0, aucune molécule de protéine immobilisée n'a fixé de molécule de ligand : la valeur RU correspond à un angle critique de départ (a).
• Puis le ligand est injecté : quand il se fixe aux molécules de protéine immobilisées, la formation du complexe modifie l'indice de réfraction à la surface de la couche d'or et la valeur RU augmente.
• La forme de l'enregistrement appelé sensorgramme permet de mesurer le taux d'association (constante de vitesse k_on).
  • A l'équilibre (P + L <=> PL), la valeur RU correspond à un angle critique final différent (b).
  • Cette valeur maximale de RU est proportionnelle à la concentration du complexe [protéine immobilisée - ligand].
• Quand on arrête d'injecter le ligand, il y a dissociation du complexe : la forme de l'enregistrement permet de mesurer la valeur de la constante de vitesse k_off.
• On détermine ainsi la constante de dissociation K_D.
• Enfin, la surface est régénérée donc ramenée à l'angle critique initial (a) et on peut effectuer une nouvelle mesure.

Exercice N°5

Interpréter la figure ci-dessous (nom de la technique, différentes phases, données obtenues, …).

Source : Wrapp et al. (2020)

Les protéines de pointe S ("spike") virales 2019-nCoV S et SARS-CoV S ont le même récepteur fonctionnel de la cellule hôte, l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2).

• L'enregistrement ci-dessus est obtenu avec la méthode de résonance plasmonique de surface (SPR) pour analyser la cinétique des interactions entre la protéine de pointe du SARS-CoV-2 ("SARS-CoV-2 spike protein") et son récepteur la protéine membranaire ACE2.

• La protéine du SARS-CoV-2 a été immobilisée sur un biocapteur et exposée à des dilutions en série d'ACE2 (de 250 nm à 15,6 nM), chacune traduite par un sensorgramme (lignes noires).

Résultats

• Voir la figure 3 de l'article Wrapp et al. (2020) Science 367, 1260 - 1263
• Les données expérimentales ont été analysées avec un modèle stoechiométrique 1 : 1 (lignes rouges).
• Les paramètres déterminés sont k_a (ou k_on) = 1,88 10⁵ M^-1.s^-1 et k_d (ou k_off) = 2,76 10^-3 s^-1.
• On détermine K_D = (2,76 10^-3 s^-1 / 1,88 10⁵ M^-1.s^-1) = 14,7 10^-8 M = 14,7 nM.

Interprétation

• ACE2 se fixe à l'ectodomaine de la protéine de pointe 2019-nCoV S de l'homme avec une affinité d'environ 15 nM.
• Cette valeur est 10 à 20 fois supérieure à celle de la fixation de ACE2 à la protéine de pointe 2019-nCoV S.
• La forte affinité de la protéine de pointe 2019-nCoV S pour ACE2 contribue probablement à la facilité apparente avec laquelle le virus 2019-nCoV se propage entre êtres humains.

Exercice N°6

Source : figure 3 - Müller-Esparza et al. (2020) Front. Mol. Biosci. 7, 9

Résultats

• L'analyse des valeurs du tableau est résumée dans la figure ci-contre.

• Comparer aux résultats de la figure 3 de l'article Müller-Esparza et al. (2020).