Optimisation des conditions d'expression et purification partielle de la forme mature de la protéine de choc thermique hsp22 recombinante de pois (Pisum sativum) Introduction |
Voir un cours sur les protéines de stress LEA et HSP. |
1. les chaperonnes moléculaires Dans la cellule, les conditions physiologiques ne permettent pas à toutes les chaînes polypeptidiques de se replier sans assistance. Il existe un groupe de protéines dont le rôle est d'aider certaines autres protéines à se replier, et c'est pour cette raison qu'elles ont été dénommées "chaperonnes moléculaires" (Ellis, 1987). Les chaperonnes existent dans toutes les cellules (eucaryotes et procaryotes) quelles que soient les conditions, mais on ne les a mises en évidence qu'à la suite d'une modification temporaire de la température optimale pour l'existence de la levure. Il y a donc une synthèse accrue des chaperonnes moléculaires après un choc thermique, mais également après d'autres types de stress comme le stress oxydatif, le déficit en eau ou l'élévation de salinité. Le froid induit la synthèse de protéines appelées "Cold Induced Protein", en nombre plus restreint et de masse molaire plus élevée. Cette profonde altération du profil protéique d'un organisme en réponse à un stress (c'est-à-dire le type de chaperonne(s) moléculaire(s) nouvellement synthétisée(s) ou sur-exprimée(s)), est spécifique non seulement de l'organisme considéré mais également, au sein d'une cellule, des compartiments qui la composent. La famille des chaperonnes moléculaires se divise en deux sous-familles de protéines, distinctes tant du point de vue de leur structure quaternaire que de leur mécanisme d'action (Gething & Sambrook, 1992 ; Ellis, 1994 ; Clarke, 1996 ; Braig, 1998 ; Ellis & Hartl, 1999) : les protéines de choc thermique (ou HSP pour "Heat Shock Protein") et les chaperonnines. Les HSP sont des protéines oligomèriques (constituées de sous-unités identiques), classées en trois grands groupes en fonction de la masse molaire des sous-unités qui les constituent :
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2. caractéristiques et fonction(s) des sHSP Les sHSP ont été mises en évidence chez quasiment tous les organismes, mais elles semblent plus particulièrement liées aux plantes, chez lesquelles elles représentent la classe majeure d'HSP (Vierling, 1991). Par ailleurs, les sHSP fonctionnent selon un mécanisme qui est indépendant de l'hydrolyse de l'ATP, contrairement aux autres membres de cette famille, notamment les HSP70 (Waters et al., 1996). Cependant, la (ou les) fonction(s) biologique(s) exacte(s) des sHSP n'est (ne sont) pas encore clairement établie(s). C'est chez le pois que l'on a mis pour la première fois en évidence une de leurs propriétés fonctionnelles : les deux sHSP cytosoliques empêchent l'agrégation de protéines dénaturées artificiellement (Lee et al., 1995). En conséquence, puisque :
il a été proposé que les sHSP mitochondriales, et notamment l'HSP22, jouent un rôle clé dans le maintien du métabolisme aérobie en conditions de stress (Lund et al., 1998). |
3. l'HSP22 de mitochondries de feuilles de pois Après l'application d'un stress thermique (40°C, 3 h), les mitochondries de feuilles de pois ont été isolées et l'HSP22 a été purifiée à partir des protéines de la matrice mitochondriale (Lenne & Douce, 1994). Le séquençage de l'extrémité N-terminale a permis d'isoler un ADNc de 883 nucléotides (Figure 1) contenant une phase de lecture ouverte de 606 paires de bases, par criblage d'une banque d'ADNc de feuilles de pois (Lenne et al., 1995). La séquence traduite code une protéine précurseur d'une masse molaire apparente de 22,9 kDa (l'HSP22 est une protéine codée par un gène nucléaire). Le précurseur est adressé vers la mitochondrie et la forme mature de l'HSP22 est une protéine de 170 acides aminés d'une masse molaire prédite de 19,5 kDa. Enfin, l'HSP22 fonctionnelle est une protéine oligomèrique d'une masse molaire apparente de 230 kDa (Lenne & Douce, 1994). La séquence codant la forme mature de l'HSP22 a été clonée dans le vecteur d'expression pET-3a. Le travail réalisé au cours de ce stage a consisté à :
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